饱和氢气盐水对大鼠急性肺损伤的保护作用

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是各种原因导致的肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤引起弥漫性肺间质及肺泡水肿,从而出现以呼吸窘迫及进行性低氧血症为特征的临床综合征。其典型组织病理学改变表现为弥漫性肺泡损伤。尽管我们对 ARDs发病机制的认识较前取得了显著提高,但是仍无法准确判断肺损伤的进程及预后[1]。ARDS的病因各不相同,发病机制复杂,但被激活的各种细胞经呼吸爆发产生大量活性氧(reactive αygen species,ROS)引起氧化应激状态,在ARDS发病机制中具有重要作用。油酸致肺损伤动物模型于 1968年由Ashbaugh和Uzawa首先应用,其后一直被用于制作脂肪栓塞综合征致急性肺损伤(ALI)模型[23]。注射油酸后豚鼠支气管肺泡灌洗液中脂质过氧化产物和乳酸脱氢酶水平增高,谷胱甘肽与二硫化谷胱甘肽之比降低「3J。用触酶和超氧化物歧化酶预处理后,氧自由基的产生减少,肺水肿也减轻;提示氧化应激参与油酸致肺损伤发生。

最近研究发现,氢分子是具有选择性抗氧化作用的物质之一,能选择性清除羟自由基,并有效保护组织避免氧化损伤。有研究「56]表明,呼吸2%的氢气6h,可以非常有效地治疗严重脓毒症所致的多器官功能障碍。有文献[7]已经制备出了氢的生理盐水饱和溶液,可采用腹腔或静脉注射,使给药更为简便,剂量更精确,成为临床更理想的给药手段。已证实该注射液可改善新生儿轻度脑缺血缺氧损伤[7],对小肠缺血-再灌注损伤[:]、小肠缺血一再灌注后引起的肺损伤[9]、心肌损伤[iO]均具有保护作用。近期研究[n12]证明,注射氢气生理盐水能有效治疗烫伤及缺血-再灌注后所致的肺损伤。然而氢气生理盐水是否对油酸导致的大鼠ALI也有保护作用尚不明确。因此,本研究旨在探讨饱和氢气盐水在油酸导致的大鼠ALI中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 成年雄性sD大鼠gO只,体质量犭0~ 3OO g,购于西普尔-必凯实验动物有限公司SCXK (沪)2008-OO16。大鼠实验前7d驯养于自然日夜周期环境中,自由获取食物及水。所有实验过程均经上海交通大学医学院实验动物管理委员会批准。

1.2 物品及试剂 饱和氢气生理盐水由第二军医大学孙学军教授提供,每周新鲜配制,4℃ 保存,以确保恒定的浓度。高纯度油酸(Sigma公司);丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MP0)检测试剂购于南京建成生物工程研究所;月中瘤坏死因子-α (TNF- α)、白细胞介素-1β (IL-1β )、NF-κB Ⅱ5酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供。微量电动组织匀浆机(KIMBLE美国)。

1.3 实验设汁大鼠实验前12h禁食,自由饮水。实验过程中自主呼吸空气。用3%戊巴比妥钠(0.2mL/100g) 腹腔注射麻醉,仰卧固定。右股动脉置管,并连接生理记录仪监测血压、心率,同时可用于动脉血标本采集。置管后观察5~10min,大鼠血流动力学状态稳定并有自主呼吸,待血压平稳5血n后检测血气。然后将大鼠随机分为四组:对照(I)组、肺损伤(Ⅱ )组、肺损伤静脉H2干预(Ⅲ )组和肺损伤腹腔H2干预(Ⅳ )组。I组大鼠予股动脉置管,待血流动力学稳定后经尾静脉注人生理盐水0.1mI/ kg;Ⅱ 组大鼠予股动脉置管,待血流动力学稳定后经尾静脉注入高纯度油酸0.1m1/kg;Ⅲ 组油酸注射方法及剂量同Ⅱ组,并于注人油酸5血n后以5mI/ 砣剂量经尾静脉注射饱和氢气生理盐水,同时予 I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组尾静脉注射等量生理盐水;Ⅳ 组是肺损伤腹腔H2干预组,油酸注射方法及剂量同Ⅱ 组,并于注人油酸5而n后以5mI/吒剂量给予大鼠腹腔注射饱和氢气生理盐水,同时予I、Ⅱ、Ⅲ组腹腔注射等量生理盐水。所有大鼠于注射油酸3h 后再次经股动脉置管处采血检测血气,随后处死动物。取左下肺福尔马林固定进一步行病理学检查。左上肺组织及右肺用4℃ 生理盐水漂洗,除去血液, 滤纸拭干,用微量电动组织匀浆机制成10%组织匀浆,用于MDA、MP0以及肿瘤坏死因子-α (TNF- α)、白细胞介素-1β (IL-1β )和NF-κB Ⅱ5的检测。

1.4 病理组织学观察 左下肺组织用生理盐水冲洗,福尔马林固定狃h,常规石蜡包埋,制成4um 切片,HE染色后于光学显微镜下观察病理改变。

1.5 肺组织MP0活性和MDA含量的测定 取 10%肺组织匀浆分别使用相应试剂,严格依据操作手册进行肺组织MP0活性及MDA含量测定。

1.6 月市组织TNF-α 、IL~1β 及NF-κB p65含量测定 肺组织TNF-α 、IL-1β 和NF-κB Ⅱ5的测定分别使用相应试剂盒并严格依据操作手册进行。

1.7 统计学处理 采用叩“13.0软件进行统计分析,计量资料实验结果以均数±标准差(死±s)表示, 正态分布变量多组间比较用方差分析,非正态分布变量用秩和检验,两组间比较用莎检验,以P<0。O~s 为差异有统计学意义。

2 结果

2,1 动脉血气分析 与注射油酸前比较,Ⅱ 组、Ⅲ 组和Ⅳ组在注射油酸3h后Pao2显著降低(P< 0.05)。同时与I组比较也存在h02显著降低 (P<0.05)。此外,Ⅲ 组和Ⅳ组Pao2显著高于对照组(P<0。Os),且Ⅳ组Pao2高于Ⅲ组(P(0.Os)。各组中Paco2、sa02和HCOJ差异无统计学意义 (P)0.05)。见表1。

2.2 肺组织病理学变化 对照组大鼠肉眼可见肺呈粉红色,表面光滑,无渗出及出血,光学显微镜下见肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺泡内未见渗出液(见彩色插页图1A)。Ⅱ组大鼠肺组织出现严重损害, 肉眼见整个肺充血,间有斑片状坏死,镜下见肺间质水肿,弥漫性出血,广泛炎细胞浸润(彩色插页图 1B)。Ⅲ、Ⅳ组大鼠表现为较轻的肺水肿,镜下可见肺泡出血及炎细胞浸润,且Ⅳ组肺水肿、肺泡出血及炎细胞浸润较Ⅲ组为轻(见彩色插页图1C、D)。

2.3 肺组织MP0活性和MDA含量的变化 肺组织MPO活性和MDA含量的测定结果提示,I组不存在肺损伤。然而,与I组比较,Ⅱ 组肺组织MP0 活性及MDA水平显著增加(P<0.01);Ⅲ 组和Ⅳ组肺组织MP0活性及MDA水平明显增加(P( 0.05),Ⅲ 组和Ⅳ组肺组织MP0活性及MDA水平与Ⅲ组比较显著降低(P(0.0~s),且Ⅳ组肺组织 MP0活性及MDA水平较Ⅲ组低(P<0.“ )。见图 2.4 饱和氢气盐水对TNF-α 、IL-1β 禾日NF-κB p65的影响 EⅡsA检测提示,I组、Ⅲ组和Ⅳ组大鼠肺组织TNF-α 、IL-1β 和NF-κB Ⅱ5水平明显高于对照组(P(0.“ )。Ⅲ组和Ⅳ组与Ⅱ组比较可降低油酸致肺损伤大鼠肺组织TNF-α 、IL-1β 和 NF-KB p65水平(P<0.∞ ),且Ⅳ组较Ⅲ组可更进一步降低油酸致肺损伤大鼠肺组织TNF-α 、IL- 1β 和NF-κB p65,X平(P(0.05)。 见表2。

3 讨论该研究表明,饱和氢气盐水能够降低大鼠油酸肺损伤模型中肺的损伤程度。血气分析和病理组织学分析也支持上述结果。此外,饱和氢气盐水还可以降低损伤肺组织中MDA水平及MP0的活性,该结果伴随细胞困子(TNF-α、IL-1β )和NF-κB p65表达下降,且经腹腔注射给药效果更好。许多研究[旧]已经表明,油酸较低浓度就可与生物膜结合,直接的细胞膜损伤作用是其致肺损伤的重要原因。在肺损伤的病理过程中,迅速增加的氧自由基,引起不饱和脂肪酸过氧化,导致细胞膜受损。丙二醛为不饱和脂肪酸过氧化最终产物,它的含量可以反映脂质过氧化的程度。

本研究发现,注射油酸后肺组织内丙二醛明显增加,经饱和氢气盐水治疗后丙二醛含量显著减少。MP0占中性粒细胞干质量的5%,因此,MP0的活性可以用于估计肺内中性粒细胞的数目,并且成为评价肺损伤的指标。在本研究中发现,大鼠肺组织中MPO活性在注射油酸后显著增加,经饱和氢气盐水干预后MPO活性可回落,提示饱和氢气盐水能减轻油酸所致大鼠肺损伤,可能是通过抑制肺组织炎细胞浸润而产生[12], 且经腹腔注射给药效果更好。油酸致肺损伤模型中所发生的氧化应激与全身炎症反应密切相关。有研究发现,静脉注射油酸4h 后,小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞计数、单核细胞、嗜中性粒细胞数明显增高;内源性内皮素可促进嗜中性粒细胞向肺内浸润,增加毛细血管血浆外渗[1° ]。

油酸致肺损伤后,外周循环血中花生四烯酸及代谢产物水平明显升高,引起肺静脉压增高,加重肺水肿。肺损伤常导致组织氧合降低,进一步加剧了全身炎症反应。最近的研究显示,氧化损伤与炎症反应的发生受NF-κB激活所调控。激活的巨噬细胞和中性粒细胞,释放TNF-α 及IL-1β ,进一步使全身炎症反应放大。目前已证实,肺损伤的发生与TNF-α 和IL-Iβ 的激活有关[1s“ ]。本研究结果显示,饱和氢气盐水能显著降低损伤肺组织中 TNF-α 和IL-1β 水平。此外,我们还发现,饱和氢气盐水能降低NF-KB Ⅱ5的表达,提示NF-κB 的激活可能与油酸导致肺损伤的病理过程有关。因此,饱和氢气盐水对肺损伤的保护作用可能是通过减少NF-KB Ⅱ5的表达,降低TNF-α 、IL-1β 水平,进而抑制了肺组织内的炎症级联反应[1l~⒓ ]。本研究结果显示,经腹腔或尾静脉注射饱和氢气盐水能减轻油酸所致大鼠肺损伤,且经腹腔注射给药效果更好,结合日本学者研究"]发现,连续(8 h/d)小剂量(0。Og ppm)给动物饮用1/20饱和浓度 (1.5ppm)的含氢水对MPTP诱导的巴金森病有显著治疗效果,提示氢的有效治疗浓度可能很低,经腹腔给药能持续较长时间维持有效浓度,即便药物峰值浓度较低但其作用优于一次性静脉大剂量给药, 提示连续小剂量给药可能为最佳给药方式。

5 结论饱和氢气生理盐水能够降低大鼠油酸肺损伤模型中肺的损伤程度,且经腹腔注射给药效果更好。其机制可能与氢分子在体内的选择性抗氧化作用以及对肺组织内炎细胞浸润和炎症级联反应的抑制有关。同时,氢作为生物抗氧化剂有非常鲜明的优点。首先,氢的还原性比较弱,只与活性强和毒性强的活性氧反应,不与具有重要信号作用的活性氧反应[1:]。其次氢本身结构简单,与自由基反应的产物也简单,例如与羟自由基反应生成水,多余的氢可通过呼吸排出体外,不会有任何残留,这明显不同于其他抗氧化物质,如维生素C与自由基反应后生成对机体不利的代谢产物(氧化型维生素C),这些产物仍需要机体继续代谢清除。另外,氢气具有制备容易、价格便宜、无毒等诸多优点,可能成为治疗ALI 的有效方法。但其作用机制及更加实用的给药方法、合理的药物剂量有待进一步探讨。

参考文献

[1] Hubloue I,Biarent D,Abdel kafi S . Endothelin receptor blockade in canine oleic acid-induced lung injury . Intensive Care Medicine , 2003年 29卷 第06期

[2] Fonte DA,Hausberger FX . Pulmonary free fatty acids in experimental fat embolism . Journal of Trauma-Injury Infection and Critical Care , 1971年 11卷 第08期

[3] Mao YF,Zheng XF,Cai JM . Hydrogen-rich saline reduces lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats . Biochemical and Biophysical Research Communications , 2009年 381卷 第04期

[4] Sun Q,Cai J,Liu S . Hydrogen-rich saline provides protection against hyperoxic lung injury . Journal of Surgical Research , 2011年 165卷 第01期

[5] Douzinas EE,Kollias S,Tiniakos D . Hypoxemic reperfusion after 120 mins of intestinal ischemia attenuates the histopathologic and inflammatory response . Critical Care Medicine , 2004年 32卷 第11期

[6] Fujita K,Seike T,Yutsudo N . Hydrogen in Drinking Water Reduces Dopaminergic Neuronal Loss in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Mouse Model of Parkinson's Disease . PLoS One , 2009年 4卷 第09期

[7] Xie K,Yu Y,Zhang Z . Hydrogen gas improves survival rate and organ damage in zymosan-induced generalized inflammation model . Shock , 2010年 34卷 第05期

[8] Cai J,Kang Z,Liu K . Neuroprotective effects of hydrogen saline in neonatal hypoxia-ischemia rat model . Brain Research , 2009年 1256卷

[9] Fang Y,Fu XJ,Gu C . Hydrogen-rich saline protects against acute lung injury induced by extensive burn in rat model . JOURNAL OF BURN CARE & RESEARCH , 2011年 32卷 第03期

[10] Ohsawa I,Ishikawa M,Takahashi K . Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals . Nature Medicine , 2007年 13卷 第06期