化痰平喘汤对支气管哮喘小鼠干细胞因子表达的影响

支气管哮喘(简称哮喘)是气道反应性炎症,以气道高反应性(“rway high reaction,AHR)为特征。肥大细胞是哮喘发病过程中关键的炎症细胞,干细胞因子(stem ccll hctor,SCF)又名肥大细胞生长因子,在肥大细胞发育和存活中起关键作用。本实验通过观察化痰平喘汤对哮喘小鼠肺组织SCF表达的影响,探讨药物治疗哮喘的可能作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物健康8周龄雌性BAILB/c小鼠50只,随机分为空白对照组、模型组、醋酸泼尼松组、化痰平喘汤组、化痰平喘汤+醋酸泼尼松组,每组10只。

1.2主要试剂V级卵白蛋白(美国Slgma公司,批号:9006-59△。醋酸泼尼松片:浙江仙琚制药股份有限公司,批号:090685。化痰平喘汤流浸膏:浙江中医药大学制剂室制各。免疫组织化学检测试剂盒EnVisionTM:丹麦DAKO公司,批号09J2775A。BA1387兔来源多克隆抗体SCF:武汉博士德生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1哮喘模型建立实验第1天小鼠体内多点注射OVA致敏液0.5ml,第15天腹腔注射致敏液0.2m1加强致敏。第22天将小鼠置于透明密闭箱中,以1%OVA溶液按最大雾化量超声雾化,小鼠自然吸入30min,每天l次,共7d。以烦燥、挠鼻、抓身、咳嗽、喷嚏、呼吸急促深快及点头运动等症状出现为激发成功。

1.3.2药物干预实验第22天各组开始灌胃,每天1次,共14d,根据体表面积比等效剂量换算用药剂量。化痰平喘汤组给予化痰平喘汤流浸膏15。8g°kg l畲d1;醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松混悬液5mg°kg1.dl;化痰平喘汤+醋酸泼尼松组给予化痰平喘汤流浸膏15,8g·kg l·dl及醋酸泼尼松混悬液2,5mg·kg l·d1;空白对照组及模型组相应给予等量生理盐水。

1.3.3标本制各实验第35天末次激发30min后910%水合氯醛(0,1ml/只)腹腔注射小鼠,开胸取小鼠肺组织,4%多聚甲醛固定24h,一部分待行病理,一部分待免疫组织化学检测。

1.3.4 博肺组织sCF蛋白表达小鼠肺组织切片经免疫组织化学染色后,使用Image Pr°Plus5.0图像分析软件对sCF蛋白表达采用定量检测分析。每张切片随机采集2~3个视野(×200倍),测量其阳性细胞的10D值,经系统分析获得该视野的IOD值9平均后代表该标本的染色强度。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,所有数据以J土s表示,采用单因素ANOVA,组间两两比较,方差齐性时用ILSD检验,方差不齐时用Dunnctt′sT3检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠一般情况空白对照组小鼠毛色光洁,呼吸平稳,反应灵敏。各造模组OVA雾化不久即出现烦燥不安,头面部搔痒,呼吸急促,后逐渐口唇紫绀,行动迟缓。各药物干预组随着药物的应用,症状明显减轻。多次激发后,模型组小鼠形体消瘦,毛色祜槁,精神萎靡、反应迟钝。醋酸泼尼松组形体消瘦,毛色失去光泽,易激惹。化痰平喘汤组、化痰平喘汤+醋酸泼尼松组用药后期毛色逐渐恢复润泽,反应逐渐灵敏。

2.2肺组织病理学帘白对照组小鼠肺泡结构正常,支气管L皮完整,纤毛排列整齐,细支气管周围未Jl明显炎症细胞(图1)。模型组小鼠肺泡结构不规则,部分支气管上皮细胞脱落,管壁增厚、管腔狭窄,周围有大量炎症细胞(图2)。醋酸泼尼松组小鼠肺泡结构基本正常,支气管上皮较完整,管壁增生减轻,周围有少量炎症细胞(图3)。化痰平喘汤组小鼠肺泡EOS、巨噬细胞和少量血管内皮细胞的胞浆内可见较多炎症细胞,但较模型组明显减轻(图4)。化痰平喘汤+醋酸泼尼松组小鼠肺泡结构基本正常,支气管上皮较完整,管壁增生明显减轻,周围有少量炎症细胞(图5)。

2.3肺组织SCF蛋白表达各组小鼠肺组织SCF蛋白表达用图像分析软件进行定量分析,由表1可知,模型组及各药物干预组SCF的IOD值明显增高,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P(0,01);各药物干预组SCF的IOD值明显降低,与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.01);化痰平喘汤组较醋酸泼尼松组SCF的IOD值增高,两组间差异有统计学意义(P<0.05);化痰平喘汤+醋酸泼尼松组与醋酸泼尼松组SCF的IOD值差异无统计学意义(P>0,05)。

3分析与讨论

中医认为哮喘发作期主要为风痰痹阻,痰阻气道,以实为主,《证因脉治》谓:哮喘之因,痰饮留伏,结成窠臼,潜伏于内,偶有七情之犯,饮食之伤,或外有时感之风寒,束其肌表,则有哮喘之证作矣。化痰平喘汤由前胡15g,苏子12g,杏仁12g,枇杷叶10g,蝉衣6g,陈皮10g,芾刂半夏10g,茯苓12g,白芷10g,苍耳子10g,地肤子10g,白鲜皮10g,紫草15g,茜草15g,鱼腥草30g,月市形草30g,生甘草6g组成,前胡、苏子、杏仁宣肺化痰、降气平喘,为方中主药;枇杷叶降肝气最佳,肝气降则肺气自降,夫肺为娇脏,畏寒畏热,其间毫发不容,其性亦以下行为顺,上行为逆为喘;半夏、茯苓、陈皮健脾胃化痰湿,去其痰湿之根源;蝉蜕、白芷,取其透发之力强也,合紫草、茜草、鱼腥草、肺形草等对热郁闭于肺而不出者效甚佳;治肺者,惟恐偏于一性,稍加苍耳子、地肤子、白鲜皮等轻透而又微温微寒之药,合以生甘草调和诸药。近年来研究发现肥大细胞在哮喘早期相反应中发挥重要作用,通过活化释放组胺、蛋白酶、IIL4、嗜酸细胞活化趋化因子等引起支气管平滑肌痉挛,毛细血管通透性增加,黏膜腺体分泌增加,并趋化炎症细胞浸润,最终导致气道炎症和气道高反应性[1]。

目前认为气道炎症是哮喘AHR的基础,而气道反应性的高低是哮喘临床症状加重或缓解的主要因素。SCF作为肥大细胞生长因子,可促使CD扯+祖细胞在骨髓和外周血中增殖分化为肥大细胞,并诱导肥大细胞脱颗粒[2],还能增强肥大细胞在外界炎性介质或信号途径刺激下分泌细胞介质。SCF/c kit诱导肥大细胞中磷脂酶Cγ磷酸化后,激活整合素β亚族中的极晚期抗原5活性,从而增强肥大细胞的黏附作用,加重局部的炎性反应和气道高反应性。此外9SCF通过引起Forkhead转录因子的失活和凋亡,延长肥大细胞存活时间[丬。本研究应用化痰平喘汤干预哮喘小鼠,结果显示药物可抑制哮喘小鼠气道炎症,并可明显降低小鼠肺组织SCF蛋白的表达水平,表明化痰平喘汤抑制气道炎症的作用与其在一定程度调控SCF水平有关。化痰平喘汤与小剂量醋酸泼尼松联用与大剂量醋酸泼尼松组差异无统计学意义,表明化痰平喘汤可减少糖皮质激素治疗剂量。

参考文献

[1]Campbell E,Hogaboam C,Lincoln P.Stem cell factor induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice[J].American Journal of Pathology,1999.1259-1265.

[2]Welker P,Grabbe J,Zuberbier T.Mast cell and myeloid marker expression during early in vitro mast cell differentiation from human peripheral blood mononuclear cells[J].Journal of Investigative Dermatology,2000.44-50.

[3]Dastych J,Metcalfe DD.Stem cell factor induces mast cell adhesion to fibronectin[J].Journal of Immunology,1994.213-219.

[4]M(o)ller C,Alfredsson J,Engstr(o)m M.Stem cell factor promotes mast cell survival via inactivation of FOXO3amediated transcriptional induction and MEK regulated phosphorylation of the proapoptotic protein Bim[J].Blood,2005.1330-1336.