B7-H1及其受体PD-1在膀胱癌患者外周血免疫细胞中的表达及其临床意义
发表时间：2014-05-09 浏览次数：640次
T细胞介导的免疫应答是机体抗肿瘤免疫的主要形式,也是肿瘤细胞发生免疫逃逸的关键环节。共刺激分子B7—H1是近年来发现与肿瘤免疫逃逸密切相关的重要免疫抑制分子,其与受体PD1结合后,在T细胞免疫应答的初始阶段和效应阶段均可抑制T细胞的活化,从而抑制T细胞介导的免疫应答。以往研究表明,膀胱癌中存在着免疫逃逸现象,而这也可能是膀胱癌发生发展和易复发的重要机制之一。那么B7H1/P91抑制性信号与膀胱癌的免疫逃逸,尤其是在抗肿瘤免疫应答的初始阶段有无关系目前国内外鲜见报道。为此,本研究应用流式细胞术检测B7-H1和PD1在膀胱癌患者外周血免疫细胞中的表达情况,借此探讨B7-H1/PD1在膀胱癌免疫逃逸机制中的作用及其临床意义。
1资料与方法
1.1临床资料收集2012年5~9月青岛大学医学院附属医院泌尿外科膀胱癌患者外周血30例,术后病理检查均证实为膀胱癌。其中男24例,女6例,年龄41~76岁,平均57岁。初发肿瘤21例,复发肿瘤9例。病理分级按WHO1999年标准分级分为两组:低级别组7例,高级别组23例。临床分期按UICC的TNM标准分期分为两组:非浸润组17例,浸润组(T2~4)13例。另外取10例健康人外周血作为对照(由青岛市中心血站提供)。
1.2主要试剂重组人白细胞介素4(rhI14)、重组人粒-巨噬集落刺激因子(rhGM CSF)、重组人肿瘤坏死因子-a(rTNRa)均购自Peprotech公司;鼠抗人单克隆抗体CD8PE、P1FITC、B7H1-PE均购自Bio legend公司;RMPI164o及胎牛血清购自Gibi公司;淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。
1.3PBMC及DCs的分离与培养采用密度梯度离心法,取新鲜外周血,等量PBS稀释。50ml离心管底部加人淋巴细胞分离液,在其上方缓慢加人等量的稀释血液,以2000r/min速率离心~90min,吸取中间层单个核细胞至另一离心管中,加人5倍以上体积的PBS充分洗涤,以2O00r/min速率离心10min,再以1500min速率离心10min,弃上清液,最后将PBMC重悬于含有10%FCS的RPMI164o培养基中加人培养瓶,在37C、5%CO2条件下贴壁2h。然后在培养瓶中留存贴壁细胞,加人含有rhGM cSF(1×106U/L)和rhII'Ⅵ(5×105U/L)的RPMI164o细胞完全培养基(含10%FCS),在37°C、5%CO2条件下培养,于培养第2、4天半量换液同时加入新的rhGM_CSF和rhIL4,第6天加人rhTNFα(1×106U/L)诱导产生成熟DCs(mDCs)。
1.4流式细胞术检测mDcs表面B7H1及CD:+T细胞表面P1的表达水平分别收集培养2h后的PBMC及刺激成熟的mDCs,以2000r/min速率离心3min,弃上清。用PBS洗涤3次,分别加入鼠抗人单克隆抗体CD8PE、PD1FITC以及B7Hl PE,在4C中避光孵育30min,用PBS洗涤细胞3次,将细胞重悬于PBS液中,加人200ul4%多聚甲醛固定细胞,用流式细胞仪进行检测。
1.5统计学处理结果数据用均数土标准差(x±s)表示。采用SPSS19.0统计软件进行数据处理,数据间比较采用检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 B7H1和P,l在正常人及膀胱癌患者外周血mDcs和CD:+T细胞表面的表达情况B7—H1在正常人外周血mDcs中均有表达(7/7),表达强度平均值为9.69%(图1①)。B7-H1在膀胱癌患者外周血mDcs中亦均有表达(30/30),表达强度平均值为42.08%(图1②),与正常人相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。P△1在正常人外周血CD:T细胞中无明显表达(0/10),但在膀胱癌患者外周血中均有表达(30/30),表达强度平均值为46.71%(图1③,图1④),与正常人相比,差异有显著统计学意义(P(0.01)。
2.2B7H1和PD1表达水平与膀胱癌生物学行为的关系膀胱癌患者外周血mDCs中B7H1表达强度随着病理分级和临床分期的增加而增加,差异有统计学意义;膀胱癌患者外周血CD:+T细胞中PD1表达强度随着病理分级和临床分期的增加而升高,差异亦有统计学意义;另外,复发组B7—H1和P)1的表达强度高于初发组,但差异无统计学意义(表1)。
3讨论
T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要形式之一。肿瘤免疫应答的产生需要免疫系T细胞表面P△1的表达水平分别收集培养2h后的PBMC及刺激成熟的mDCs,以2000r/min速率离心3min,弃上清。用PBS洗涤3次,分别加入鼠抗人单克隆抗体CD8PE、PD1FITC以及B7Hl PE,在4C中避光孵育30min,用PBS洗涤细胞3次,将细胞重悬于PBS液中,加人200ul4%多聚甲醛固定细胞,用流式细胞仪进行检测。1.5统计学处理结果数据用均数土标准差(J±s)表示。采用SPSS19.0统计软件进行数据处理,数据间比较采用扌检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 B7H1和P,l在正常人及膀胱癌患者外周血mDcs和CD:+T细胞表面的表达情况B7—H1在正常人外周血mDcs中均有表达(7/7),表达强度平均值为9.69%(图1①)。B7-H1在膀胱癌患者外周血mDcs中亦均有表达(30/30),表达强度平均值为42.08%(图1②),与正常人相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。P1在正常人外周血CD:△T细胞中无明显表达(0/10),但在膀胱癌患者外周血中均有表达(30/30),表达强度平均值为46.71%(图1③,图1④),与正常人相比,差异有显著统计学意义(P(0.01)。
统有效识别和提呈肿瘤抗原,并活化特异性T细胞,从而产生免疫杀伤作用。而肿瘤细胞往往可以通过异常表达和(或)缺如某些免疫分子,使特异性T细胞处于无反应或免疫耐受状态,甚至导致T细胞凋亡,从而逃避机体的免疫杀伤作用,即发,生免疫逃逸现象⑷。B7H1是最近新发现的与肿瘤免疫逃逸密切相关的抑制性共刺激分子⑸,正常情况下主要表达于活化的单核细胞和DCs表面〔6〕。现已证明其在多种肿瘤细胞表面亦存在着过度表达(7〕。其与受体PD1结合后,可以提供抑制性信号抑制T细胞的活化,诱导活化T细胞凋亡〔:J〕,从而抑制T细胞介导的免疫应答。目前对B7H1参与肿瘤免疫逃逸机制的研究多着重于对T细胞免疫应答的效应阶段,即肿瘤局部微环境的研究。
我们前期研究亦发现膀胱癌细胞可以通过高表达B7H1诱导特异性T细胞的凋亡,从而抑制特异性T细胞的杀伤作用.但在T细胞免疫应答的初始阶段.特别是在DC刺激T细胞活化的阶段,是否也存在着B⒎H1/PD1介导的免疫逃逸机制呢?本研究发现,B7H1在膀胱癌患者外周血mDCs中表达明显增高,P91在膀胱癌患者外周血CD:T细胞中表达亦明显增高.并且其表达水平与肿瘤的病理分级和临床分期密切相关。这提示在T细胞免疫应答的初始阶段,肿瘤细胞可以通过上调DCs表面B7H1的表达,抑制其对特异性T细胞的激发作用,从而抑制机体的抗肿瘤免疫应答。日前诱导DCs表面B7-H1表达上调的机制尚不清楚。Qlan等研究发现在肿瘤微环境中TI'R4信号通路的活化可以上调B7—H1的表达,提示TLR4有可能是B⒎H1上游参与机体免疫应答和肿瘤免疫逃逸的重要分子,其具体的信号传导机制值得进一步研究。综上所述,我们认为,B7H1/PD1在T细胞免疫应答的初始阶段亦参与了膀胱癌免疫逃逸的发生,这对于完善膀胱癌免疫逃逸的机制,探索膀胱癌高复发性的原因,并在此基础上寻求膀胱癌免疫治疗的新策略有着重要的意义。而B⒎H1/PD1表达上调的具体机制尚有待进一步的深入研究。
