深圳市南山区腹泻患儿诺如病毒筛查及其基因分型研究

病毒性腹泻在感染性腹泻中较为常见，其中主要是轮状病毒腹泻和诺如病毒腹泻。诺如病毒现在被认为是引起散发和流行胃肠炎的主要原因。但目前仍有许多省份地区未将其列为常规检测和报告项目，对诺如病毒感染和发病状况的了解甚少，因此，为了解深圳市南山区诺如病毒感染的基因型、发病季节、疾病趋势以及婴幼儿年龄与感染诺如病毒的关系，本研究对腹泻的患儿粪便标本进行诺如病毒检测，为本地区该病毒的流行情况积累资料。

1　材料与方法

1.1　材料　收集深圳市第六人民医院(南山医院)2010 年9月至2011年1月、2012年9月至2013年3月秋冬季5岁以下急性非细菌性腹泻婴幼儿的粪便标本748份。腹泻诊断标准：每日大便次数增加(≥3次)或大便性状发生明显改变(包括稀水样、蛋花样、黏液样或稀糊样等)。标本在患者腹泻急性期采取，置于无菌容器，立即送实验室，用生理盐水混匀，制成10%的悬液，于-80 ℃保存。

1.2　仪器试剂　PTC200基因扩增仪(美国MJRESEARCH公司)，BIORAD 电泳仪(美国BIO 公司)，病毒DNA、RNA提取试剂盒，DNA 凝胶纯化试剂盒(美国Axygen 公司)，聚合酶链反应试剂盒(美国Fermentas公司)，逆转录聚合酶链反应试剂盒(美国QIAGEN 公司)，RNA 酶抑制剂(Promega 公司)。

1.3　方法

1.3.1　核酸提取　病毒DNA、RNA 提取试剂盒购于QIAGEN 公司，严格按照说明书操作，提取的核酸标本每份有80 μL，在每份标本中加入RNA 酶抑制剂1.5μL，-80 ℃ 保存备用。

1.3.2　引物选择　参照A 组轮状病毒、诺如病毒和星状病毒、国际参考株序列，分析病毒基因组保守区，根据保守区基因序列选用Primer5.0 软件设计多重逆转录聚合酶链反应引物。所设计引物通过Internet在美国生物技术信息中心(NCBI)上BLAST 后(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)初步验证其特异性。聚合酶链反应体系用β2微球蛋白的基因片断作为扩增靶序列基因的内部参照物。引物均由Invitrogen公司合成，序列详见表1。肠道腺病毒扩增的上游引物为5′GAT ATGCAGCAT GTA TTCCTT TTTCCG AAA CTTCCA3′，下游引物为5′ATAGGTACGCCACATGGTGCGATCGCA3′，引物由Invitrogen公司合成。

1.3.3　多重逆转录聚合酶链反应体系　模板RNA1μL;逆转录聚合酶链反应缓冲液2μL;dNTP 混合液0.4μL;逆转录聚合酶链反应酶混合液0.4μL;RNase抑制剂0.05μL;引物β2微球蛋白0.05μmol/L、轮状病毒0.05μmol/L、诺如病毒0.05μmol/L 和星状病毒0.02μmol/L(均指引物终浓度);总体积10 μL。肠道腺病毒0.2 μL(引物终浓度为10 μmol/L)。

1.3.4　逆转录聚合酶链反应程序　50 ℃ 反转录30 min;95 ℃变性15min;循环步骤为94 ℃变性45s，55 ℃ 退火45s，72 ℃延伸1min，进行35 个循环;最后72 ℃延伸10min，冷却到4 ℃。

1.3.5　聚合酶链反应产物检测、纯化和测序确证　诺如病毒阳性扩增产物的纯化在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(Axygen 公司)纯化，严格按说明书操作，可最终获得25～30μL 洗脱体积。经纯化、回收的诺如病毒阳性扩增产物，用BECKMAN COULTER 公司生产的CEQ8800 测序仪进行核苷酸序列测定。测序反应所有加样的过程均须置于冰上进行。测序所得序列输入GenBank数据库，用BLAST 进行同源性比对。

1.4　统计学处理　应用统计软件SPSS17.0对计数资料进行 χ 2 检验或确切概率法，双侧α=0.05，以p<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　总感染情况　在748份标本中，共检出384 例至少感染1种腹泻病毒，总检出率为51.33% (384/748)，其中301 例感染1种腹泻病毒，47例为2种以上腹泻病毒混合感染，其中2例感染3种腹泻病毒。各病毒检出数及检出率。

2.2　诺如病毒感染病例年龄分布　诺如病毒感染以2岁以下婴幼儿为主，感染数占全部病例数的95.20%(119/125)。1 岁以内感染率占86.40% (108/125)，与1 岁以上月份比较差异有统计学意义(χ 2=132.50，p<0.01)。11 个月、12 个月患儿的诺如病毒阳性率最高，见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。另外小于6个月婴幼儿与大于6个月小于12个月的婴幼儿感染率相比，差异有统计学意义(χ 2=75.81， p<0.01)。

2.3　诺如病毒感染病例性别比　125例诺如病毒抗原检测阳性标本中，男性57例，女性68例，男女性别比为1∶1.19，两者比较差异无统计学意义(χ 2=1.94，p>0.05)。

2.4　诺如病毒与其他病毒混合感染情况　125例诺如病毒阳性患儿中，有14例是混合感染，其中8例是与轮状病毒混合感染，4例是与肠道腺病毒混合感染，另2例是与轮状病毒、肠道腺病毒同时感染，混合感染率为11.20%(14/125)。轮状病毒混合感染率为11.89% (27/227)，肠道腺病毒混合感染率为37.31%(25/67)，星状病毒混合感染率为14.29%(2/14)。肠道腺病毒混合感染率与诺如病毒混合感染率比较差异有统计学意义(χ 2=11.54，p<0.01)。轮状病毒混合感染率与诺如 病毒混合感染率比较差异无统计学意义(χ 2 =0.03，p>0.05)。星状病毒混合感染率与诺如病毒混合感染率比较差异无统计学意义(χ 2=0.02，p>0.05)

2.5　诺如病毒感染季节分布　125 例诺如病毒阳性患儿中，11 月份诺如病毒的检出率最高，占总例数的36.00% (45/125);其次是10月份，占总例数的29.60%(37/125)，要明显高于其他各月。9、12、1、2、3月所占比例依次为11.20%(14/125)、11.20% (14/125)、4.80% (6/125)、4.80% (6/125)、2.40%(3/125)。与10、11 月比较差异有统计学意义(χ 2 =19.47，p<0.012.6　诺如病毒基因分型　将聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳目的条带应用Axygen 公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit进行切胶纯化后作测序反应，应用BECKMANCOULTER 公司CEQ8800测序仪进行核苷酸正反向测序。将所得序列输入GenBank，经BLAST 比对，125例诺如病毒阳性标本中有114株经聚合酶链反应产物纯化、测序成功，并对部分核甘酸同源性进行分析。结果表明，114株诺如病毒阳性标本均属于诺如病毒GⅡ型，同源性为98%～100%，114株诺如病毒阳性标本均为GⅡ4 型，未发现GI型。

3　讨　　论

对收集的门诊临床确诊为非细菌腹泻的患儿粪便标本同时进行轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和诺如病毒检测，结果显示在748份标本中，384 例至少感染1 种腹泻病毒，总检出率为51.33%(384/748)。轮状病毒是最主要的病原(30.35%)，其后依次诺如病毒(16.71%)、诺如病毒(8.95%)、星状病毒(1.87%)。国内外大量研究表明轮状病毒是婴幼儿病毒性腹泻的最主要原因，其中大部分报道轮状病毒阳性率为31% ～68%，不同研究轮状病毒阳性率的不同主要由于研究条件、样品处理方法、地域和社会经济水平差异以及标本的季节性而引起[1]。本实验轮状病毒检出率为30.35%，比上述报道比例略低。可能因为近年来深圳地区有轮状病毒的计划免疫，婴幼儿可以服用轮状病毒糖丸进行预防。肠道腺病毒的感染非常普遍，全世界均有报道，婴幼儿急性腹泻中肠腺病毒的检出率为1% ～20% 不等[2]，如突尼斯儿童腹泻的检出率为10%，成人为7%[3]，我国福州市的检出率4.8%，上海地区的检出率4.7%，本实验结果为8.95%，与国外报道基本一致。星状病毒检出率为1.87%，低于兰州地区[4]，尽管它的检出率不高，但仍不容忽视。本研究通过对2010～2013年深圳市南山区秋冬季腹泻患儿的监测，诺如病毒的阳性率为16.71%，低于深圳市2008年监测的诺如病毒阳性率22.59%的结果[5]，这可能与深圳市近几年来深圳市病控门对诺如病毒的监测加强了有关系。高于天津市泻患者中诺如病毒的阳性率11.89%的结果[6]，不同地区诺如病毒的流行季节或有不同，可能与检测方法也有关。我国北京、广州地区血清学研究显示，3 岁时的诺如病毒血清抗体水平就已经达到了60% ～90%，成人部分型别抗体检出率达到90%左右。本研究诺如病毒感染患儿大多为2岁以下，与河北省卢龙县杯状病毒研究[7]及上述血清抗体调查结果相符，提示小年龄段婴幼儿是诺如病毒的主要侵入对象。但是本研究显示，小于6个月的婴幼儿与大于6个月小于12 个月的婴幼儿感染率相比较，小于6个月的婴幼儿感染率明显较低，可能是因为该年龄段的婴儿大多处于母乳喂养期，乳汁中大量分泌性免疫球蛋白可起到保护其肠道黏膜的作用，从母体获得被动免疫能力尚在;而2岁以上的儿童自身分泌性免疫球蛋白增高，自体主动免疫逐渐成熟，抵抗力逐渐增强，感染率自然逐渐下降。因此加强饮食和环境卫生、切断传播途径、提高儿童主动免疫水平是预防急性腹泻的重要环节。本研究收集的流行季节腹泻患儿的标本，尚不能反映诺如病毒感染在深圳地区季节分布的特征，但可以看出10、11月份的诺如病毒感染绝对数要高于9、12、1、2、3月份，这与我国河北[7]、长春[8]等地研究结果不同，12 月发病最高，然后依次是1、2及11月份，10月份发病很低。但与广州市的研究结果大致相同[9]这可能与我国南北方气候差异有关。近年来对于腹泻病原谱监测显示，不同病毒混合感染现象非常普遍，其中以双重感染最多见，亦可见三重或多重混合感染[10]。本研究深圳地区诺如病毒性腹泻混合感染率为11.20%。其中8例是与轮状病毒混合感染，4 例是与肠道腺病毒混合感染，另2例是与轮状病毒、肠道腺病毒同时感染，混合感染率为11.20% (14/125)。混合感染率明显低于肠道腺病毒混合感染率(37.31%)与轮状病毒、星状病毒混合感染率比较差异无统计学意义(犘>0.05)。还要进一步研究其混合感染的原因。根据人类感染诺如病毒株的基因序列分析，可将诺如病毒分为3个基因群，即GⅠ、GⅡ和GⅣ，至少又可分25个基因型和大量亚群。诺如病毒在人体内不断产生遗传漂移和适应性进化，随着诺如病毒衣壳蛋白突出域中高度可变区P2区域基因序列突变的积累，GⅡ4型诺如病毒如今已成为全球流行株中占主导地位的毒株。在本实验对114份阳性标本纯化、测序结果表明均为诺如病毒的GⅡ4型，说明深圳市南山区的流行优势株为诺如病毒的GⅡ4型。长春、广州、武汉、福州、兰州等地先后开展了对诺如病毒的检测，其结果表明我国诺如病毒流行优势株为GⅡ4型。本研究结果表明深圳市南山区GⅡ4型的广泛流行与国内外的相关研究报道[1113]基本一致。但目前我国香港、福州等地GI型检出率较高[1415]。我国不同时间、地点是否存在不同流行优势株，对其分布特征和变化趋势与规律等均需进一步的研究。诺如病毒极易发生变异，在同一时期和同社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行，因此引起婴幼儿急性胃肠炎的诺如病毒易出现基因变异株。目前全球诺如病毒最主要的流行亚型是GⅡ4型，也是引起暴发疫情的最主要的亚型，不同诺如病毒亚型间还可能发生基因重组[16]。引起日本2006 年胃肠炎大流行的优势株诺如病毒GⅡ4 基因型可能部分基因发生了突变。自1997年首次发现雪山病毒自然重组株后，又发现了几株引起急性胃肠炎散发的暴发的重组株。病毒RNA 的重组是病毒进化的主要驱动力之一，近年来该病出现较大范围的流行是否与病毒基因的变异有关，由此造成的变异使诺如病毒感染的防控任务更为艰巨和复杂。今后应在深圳地区继续开展监测，加深对诺如病毒遗传变异和流行规律的进一步认识[1718]。还有在聚合酶链反应引物设计上还要不断改进，以便测定出诺如病毒不同基因组型[19]。总之，在本研究中通过探讨各种因素对诺如病毒的检出率的影响，并对其进行了基因测序，初步掌握了深圳市南山区婴幼儿腹泻中诺如病毒的感染状况，病毒的主要基因型，增加了对诺如病毒的认识，为临床的诊断、治疗用药及疫苗研究提供依据和为长期开展诺如病毒的监测工作奠定了基础[2024]。

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(收稿日期：20131023)