雷帕霉素对急性髓系白血病细胞株Kasumi1的mTOR/p70S6K 信号通路的影响

雷帕霉素又叫西罗莫司，最初是一种抗真菌和免疫抑制剂。有研究发现雷帕霉素能够抑制多种肿瘤细胞株的增殖，并导致细胞凋亡。该药物对多种癌症如非小细胞性肾细胞癌、乳腺癌、卵巢癌等有治疗作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和其下游的核糖体蛋白S6 激酶(p70S6K)可以调控基因转录、蛋白翻译、细胞凋亡等多项功能，是调控细胞生长、分化和增殖的重要因子。雷帕霉素对白血病的治疗还处于探索阶段，本文拟通过mTOR/p70S6K 信号通路研究雷帕霉素对急性髓系白血病(AML)细胞株Kasumi1 增殖和凋亡的影响，以期揭示其在白血病治疗中的分子机制。

1　材料与方法

1.1　细胞培养和处理　AML 细胞株Kasumi1购自上海细胞所。培养基使用加入10%胎牛血清和100 U/mL 双抗的RPMI1640，37 ℃、5% CO2，饱和湿度的培养箱中开放培养，每隔72h传代1次。取对数生长期的Kasumi1细胞，PBS洗涤后重悬，调整密度后重新铺板。用最适浓度100ng/mL 的雷帕霉素处理细胞36h[1]，并设立空白对照。

1.2　逆转录PCR(RTPCR)　Kasumi1 细胞经雷帕霉素处理后，胰酶消化收集，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA 纯度，选择合格的RNA 逆转录为cDNA 备用。Sybergreen法检测处理组和对照组的cDNA 表达情况。PCR引物为：mTORS 5′CGC TGA TCC CTT TAT CG3′，mTORA5′ATGCTC AAACACCTCCACC3′，引物长度为193 bp。p70S6KS5′TAG AGC CTG TGG GAC ACTATG A3′，p70S6KA5′TTTCGC ACCTGG AAC ACC3′，引物长度为142 bp。使用GAPDH 为内参，GAPDHS5′GAA GGT GAA GGT CGG AGT C3′，GAPDHA5′GAAGAT GGT GAT GGG ATT TC3′，引物长度为168bp。

1.3　细胞免疫荧光　处理细胞36h后，多聚甲醛固定细胞爬片，正常山羊血清封闭，同时加入mTOR 和p70S6K 一抗4℃ 孵育过夜。随后加入FITC(mTOR)和TRITC(p70S6K)荧光二抗，37 ℃孵育1h后DAPI染液染色30 min，抗淬灭封片剂封片。激光共聚焦显微镜观察并照相。

1.4　Westernbolt　对照和实验组的蛋白上样量均为50μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜，脱脂牛奶封闭抗原，1∶200 加入mTOR 和p70S6K 抗体，4 ℃ 过夜。洗膜，随后加入二抗，37 ℃ 杂交1h，洗涤后DAB 显色。GAPDH 为内参。

1.5　统计学处理　采用SPSS13.0 统计学软件进行分析，以犘<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　雷帕霉素处理后细胞后mTOR 和p70S6K 的mRNA 表达变化　经RTPCR 检测实验组和对照组Kasumi1 细胞中mTOR 和p70S6K 的mRNA 的表达情况发现：和对照组相比经100ng/mL 的雷帕霉素处理后，实验组中mTOR 人表达水平显著下降(0.53±0.068)，差异有统计学意义(犘<0.05)，而p70S6K 的表达水平则显著上升(1.68±0.115)，差异有统计学意义(p<0.05)，见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。提示经雷帕霉素可以抑制mTOR 的mRNA 表达，同时上调mTOR 下游靶点p70S6K 的mRNA 表达水平。

2.2　素处理后细胞前后mTOR 和p70S6K 免疫荧光结果　和对照组相比，100ng/mL 雷帕霉素处理组细胞，表示mTOR的绿色荧光表达水平下降，而p70S6K 的红色荧光表达却相对增加，见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.3　雷帕霉素处理细胞前后mTOR 和p70S6K 的Westernblot结果　Westernblot结果显示，100ng/mL 雷帕霉素处理后，实验组细胞中表示mTOR 表达显著下降，和预计结果相符合，而mTOR 下游靶蛋白p70S6K 的表达显著增加，雷帕霉素处理Kasumi1细胞前后mTOR 和p70S6K 的蛋白表达情况

3　讨　　论

AML 是一种由于多种因素所引起的骨髓性白细胞异常增殖从而阻滞了正常造血细胞而产生的恶性肿瘤。目前常用的化学治疗法虽然可以使病情得到暂时缓解，但其复发率高，患者5年后的生存率仅仅为20%[2]。信号通路的异常往往是导致正常造血祖细胞过度增殖，转录因子功能出现异常而分化为白血病细胞的重要原因[3]。有报道指出PI3K/AKT、mTORC1、ERK/MAPK、STAT3/5、Wnt/βcatenin 和NFkB等信号通路均和AML 相关。因此，针对上述信号通路的研究逐渐成为近年来AML 治疗的热点。本文拟采用雷帕霉素为mTOR 的抑制剂，研究用药前后mTOR 和其下游靶基因p70S6K 的变化情况，以探索治疗AML 的新途径。本研究发现，使用早先实验中确定的可以达到最大抑制率的雷帕霉素浓度100ng/mL 处理Kasumi1细胞后，mTOR 的mRNA 和蛋白表达水平均受到有效抑制。MTOR 是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，其在细胞的增殖、生长、凋亡和血管生成过程中发挥着重要作用。有研究结果显示mTOR 在超过70%的AML 病例中都表现为高表达[45]，通过调节其下游p70S6K 和4EBP1两个和翻译过程相关的蛋白来调控细胞的增殖过程[67]。雷帕霉素处理Kasumi1 细胞后，mTOR 下游靶基因p70S6K 的mRNA 和蛋白水平均显著上升，提示两者的表达变化呈负相关。有研究证实mTOR 被PI3K/Akt信号传导通路介导的增生信号激活后从胞浆进入胞核，并且直接使其下游的p70S6K 的Thr389位点磷酸化，pp70S6K 的促翻译活性是未磷酸化的100倍左右[8]，pp70S6K 使40S核糖体蛋白S6磷酸化，S6磷酸化使40S亚单位参与活跃的多核糖体翻译，从而增加包括编码核糖体蛋白、延长因子、胰岛素生长因子在内的含有5末端寡聚嘧啶的mRNAs的翻译[9]，抑制该通路可以使细胞周期停滞，从而导致细胞凋亡。本实验中雷帕霉素处理组mTOR 表达下调，则使p70S6K 的磷酸化过程减弱[10]，因而p70S6K 非磷酸化的p70S6K 表达上调。本研究结合前期实验基础，发现雷帕霉素可能是通过mTOR/p70S6K 途径调控AML 细胞株Kasumi1的增殖并使其发生凋亡。研究者认为在对进作用的分子机制进一步研究后，雷帕霉素有望成为AML 靶向治疗的新药物[1116]。

参考文献

[1] 柳光芬，曹柯林.西罗莫司抑制急性髓系白血病细胞株Kasumi1增殖的研究[J].国际检验医学杂志，2011，32(14)：15561557.

[2] RoweJM.Whyisclinicalprogressinacutemyelogeousleukemiasoslow[J].BestPractResClinHaematol，2008，21(1)：13.

[3] CillilandDG.Moleculargeneticsofhumanleukemias：newinsightsintotherapy[J].SeminHematol，2002，39(4)：611.

[4] TamburiniJ，ElieC，BarderV，etal.Constitutivephosphoinositide3kinase/Aktactivationrepresentsafavorableprognosticfactorindenovoacutemyelogenousleukemiapatients[J].Blood，2007，10(3)：10251028.

[5] Chen W，DrakosE，GrammatikakisI，etal.mTORsignalingisactivatedbyFLT3kinaseandpromotessurvivalofFLT3mutatedacutemyeloidleukemiacell[J].MolCancer，2010，9(1)：292283.

[6] 刘梅.PI3K/Akt/mTOR 通路与急性早幼粒细胞白血病关系的研究进展[J].医学综述，2011，17(7)：966969.

[7] 陈衍，韩晟，刘文超.PI3K/AKT/mTOR 通路调控乳腺癌细胞FASN 过表达的分子机制[J].现代肿瘤医学，2013，21(1)：14.

[8] Garber K.Rapamycin′sresurrection：anew waytotargetthecancercellcycle[J].JNatlCancerInst，2001，93(20)：15171519.

[9] ParkS，ChapuisN，TamburiniJ，etal.RoleofPI3K/AKTandmTORsignalingpathwaysinacutemyeloidleukemia[J].Haematologica，2010，95(5)：819828.

[10]AltmanJK，Sassano A，Platanias L.Targeting mTORforthetreatmentofAML.Newagentsandnewdirections[J].Oncotarget，2011，2(6)：510517.

[11]李丽，张日.mTOR 信号通路与白血病靶向治疗研究进展[J].国际输血及血液学杂志，2007，30(2)：168172.

[12]张丽红，林凤茹.雷帕霉素靶蛋白与白血病治疗[J].白血病：淋巴瘤，2008，17(6)：469471.

[13]IkezoeT，NishiokaC，TasakaT，etal.Theantitumoreffectsofsunitinib(formerlySU11248)againstavarietyofhumanhematologicmalignancies：enhancementofgrowthinhibitionviainhibitionofmammaliantargetofrapamycinsignaling[J].MolCancerTher，2006，5(10)：25222530.

[14]YuSY，LiuL，LiP，etal.RapamycininhibitsthemTOR/p70S6Kpathwayandattenuatescardiacfibrosisinadriamycininduceddilatedcardiomyopathy[J].ThoracCardiovascSurg，2013，61(3)：223228.

[15]PerlAE，KasnerMT，ShankD，etal.Singlecellpharmacodynamicmonitoring of S6 ribosomal protein phosphorylation in AMLblastsduringaclinicaltrialcombiningthemTORinhibitorsirolimusandintensivechemotherapy[J].Clin CancerRes，2012，18(6)：17161725.

[16]LiuLL，LongZJ，WangLX，etal.InhibitionofmTORpathwaysensitizesacute myeloidleukemiacellstoaurorainhibitorsbysuppressionofglycolyticmetabolism[J].MolCancerRes，2013，11(11)：13261336.

(收稿日期：20131215)