泛素蛋白酶体系统对CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用研究
发表时间：2014-04-29 浏览次数：630次
泛素一蛋白酶体系统不仅是细胞内蛋白质选择性降解的主要途径,是真核细胞内重要的蛋白质质控系统,而且参与细胞凋亡、抗原递呈、细胞周期以及细胞内信号转导等多种生理过程,对维持细胞的稳态具有十分重要的意义[1]。柯萨奇B3病毒(CVB3)是病毒性心肌炎最重要的致病病毒,在急性期导致心肌炎症、坏死,并发心力衰竭及心律失常,可导致猝死及扩张性心肌病的发生。但日前病毒性心肌炎尚无特殊有效的治疗方法[2]。最近的研究发现UPS在各种病毒感染性疾病中发挥了关键作用[3-5],本文旨在研究UPs是否在CVB病毒性`b肌炎发病过程中起了重要作用,并探讨其中的作用机制.
1对象和方法
1.1实验对象及试剂
4周龄雄性近交系SPF级BALB/c小鼠,体重(17+2)g,购于浙江省实验动物研究中心。CVB3病毒,滴度为107TCID50/0.1ml。泛素蛋白酶体抑制剂MG-132为美国Calbiochem公司生产,0.75mg/kg,用3ml,0.2%的DMS0稀释。使用的小鼠血清脑钠肽(BNP)与肌钙蛋白I(tiTnI)ELIsA试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司提供,荧光定量PCR引物及试剂盒购于大连宝生物公司。
1.2方法
1.2.1分组方法采用双盲法随机将72只小鼠分为4组:心肌炎组(CVB组),心肌炎+MG-132处理组(CVB+T组),正常对照组(Sham组),正常对照+MG-132处理组(Sham组),每组各18只。
1.2.2药物处理和标本采集前两组经腹腔注射100TCID50/0.1ml的CVB3稀释液0.1ml,后两组腹腔注射等量0.1mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。CVB+T组和sham组于接种病毒及胶腔注射PBS次日腹腔注射MG-132,0.75m酽kg,连续给药7d。第8天时,眼球后静脉丛取血,在心脏停跳前取心脏标本,将心脏沿左心室中线切为两半,一半用10%甲醛固定待做病理组织学检查,一半作led~timePCR检查。
1.2.3病理组织学检查将10%甲醛固定的小鼠心脏常规脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察心肌病理变化,其病变程度由2人分别判断取平均值,判断标准为:炎症细胞浸润,心肌坏死占每张心脏切片迓z~s%(+)计I分,乃%-s0%(++)计2分,51%J5%(+廿)计3分,)%%计4分。
1.2.4CVB3mRNA焉良达检坝刂T五zol法嫣纤汉/l、j鼠`bJJL组织总RNA。引物由大连宝生物公司合成,各引物序列见表1。反转录cDNA及荧光定量PCR反应按大连宝生物公司试剂盒说明步骤完成,测得各基因的Ct值。根据2趑蚰法进行相对定量分析,公式如下:F-⒉-(待测组目的基因平均⒍值-待测组管家基因平均Ct值)-(所有组目的基因平均Ct值-所有组管家基因平均Ct值)。
1.2.5BNP和c·TllI含量测定取小鼠血清,按小鼠BNP和t·TllIELISA试剂盒说明书步骤完成加样后,把酶标板置于笱Ollm的酶标仪上,读取各孔的0D值。根据标准品与其相对应的0D(Ⅹ)作出标准曲线及曲线方程,再根据标准曲线方程算出各样品的BNP或cTnI(Y)的量。
1.3观察指标观察各组小鼠心肌病理组织学变化,心脏重量/身体重量(HW/BW),BNP、dnI及心肌组织CVB3mRNA的表达水平。
1.4统计学处理采用叩s13,0统计软件,计量资料以厉+s表示,组间比较采用方差分析和莎检验。
2结果
2.1各组小鼠心肌组织病理变化CVB组可见明显的炎症性浸润、心肌细胞变性坏死,乩am组与乩am+T组未见异常变化,而CVB+T组小鼠炎症性浸润、心肌细胞变性坏死较CVB组减轻(图1,见插页)。
2.2各组小鼠心肌病理组织学评分及HW/BW比值比较见表2。由表2可见,组织炎症评分CVB+T组较CVB组减低(P<0.01或0.05),两组均较⒏am组及弘am+T组高(P<0.01)。cVB+T组HW/BW比值低于CVB组,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3各组BNP、cTllI及CVB3mRNA表达水平比较见表3、图2。由表3、图2可见,与CVB组相比,CVB+T组BNP、dnI水平较CVB组下降,差异均有统计学意义(均P(α05),CVB组及CVB+T组的BNP和t·TnI水平均较乩am组及乩am+T组升高,差异均有统计学意义(均P(0.01)。CVB组CVB3mRNA表达水平高于⒒am组、⒏am+T组及CVB+T组,差异均有统计学意义(均P<0,01)。
3 讨论
病毒性心肌炎目前尚无特殊有效的治疗方法,一些免疫治疗在随机临床试验中对急性病毒性心肌炎患者多无疗效,至今没有找到一种特异性抗病毒的治疗措施囵。从其他途径寻找对策,已成了国内外研究的重点。UPS在各种病毒感染性疾病中发挥了关键的作用,各种病毒能利用和操控宿主细胞的基础新陈代谢为自身所用囵,因而U"能在病毒复制周期和病毒宿主相互作用中起重要的作用。最近,国外研究U凡在病毒性心肌炎中的作用已有零星报道,但目前其机制还不清楚卩司。Gao等冂研究显示:泛素蛋白酶体抑制剂MLN353能减轻CVB3诱导的心肌炎症和超微结构变化。Ltto等㈣研究显示,U"是病毒性心肌炎心功能逐渐恶化的重要参与途径。而Raaben等网的实验结果似乎与上述研究结果不一致,他们发现泛素蛋白酶体抑制剂Vd∞de能增强冠状病毒损伤作用。本实验在CVB3病毒性心肌炎小鼠模型上给予前期研究使用剂量的蛋白酶体抑制剂(0.75m酽kg),并连续使用Td,结果显示:泛素蛋白酶体抑制剂MG-132能显著减轻心肌炎小鼠心脏病理损伤,降低HW/BW比值,MG丬32干预后第8天小鼠BNP、l·TnI显著降低,提示心肌炎症损伤及坏死明显减少,心功能改善。同时荧光定量PCR显示CVB3mRNA复制水平显著降低,提示MG△32减轻心肌损伤的作用可能是通过抑制CVB3病毒复制实现的。UPS是机体内重要的功能系统,随着近年来对UPs研究的不断深入,它在机体内的关键作用逐渐被发现H。本研究利用在体CVB3病毒性心肌炎小鼠模型,发现PS在病毒性心肌炎中发病过程中起了重要的作用。泛素蛋白酶体抑制剂可能为急性病毒性心肌炎的一种新的治疗方法,但仍需更加深人地研究。
