2种HBVDNA 荧光定量PCR 检测试剂的比较

HBV 感染是世界性公共卫生问题，全球约有3.5 亿人感染[13]，其中约有1/3的人在中国[4]。HBV 感染可导致急性或慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌[5]，因此，HBVDNA 检测对HBV感染的诊断和治疗尤为重要[6]。HBVDNA 是反映HBV 复制的最直接、最可靠的指标;在评价治疗乙型肝炎药物的疗效与预后判定方面具有至关重要的作用。目前国内生产的HBVDNA 荧光定量PCR 试剂有很多种，各试剂的灵敏度、特异度、准确度、检测范围等方面存在一定的差异。本文选用国内厂家中的两种HBVDNA 荧光定量PCR 检测试剂盒，对160例临床血清标本进行定量检测，并对其性能进行评价，现报道如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料　收集160份均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2005)》[7]的本院门诊及住院乙型肝炎患者血清，-20 ℃ 冰箱保存。

1.2　仪器与试剂

1.2.1　仪器　核酸扩增仪采用美国AppliedBiosystem 公司的ABI7300荧光定量PCR 分析仪;RT2100型酶标仪为深圳雷杜生产;上海汇松公司生产的PW960全自动洗板机。

1.2.2　试剂　HBV 核酸荧光定量PCR 试剂A 由湖南圣湘生物科技有限公司提供，其采用免核酸提取的方法，最低检测限为1.58IU/mL;试剂B为中山大学达安基因诊断试剂公司提供的试剂，采用传统的煮沸法提取病毒核酸，最低检测限为500IU/mL。HBV 免疫学检测试剂，购自厦门英科新创科技有限公司，采用ELISA 法。

1.3　方法　取已知HBVDNA 强阳性的血清1份，以阴性血清按10 倍梯度系列稀释，获得系列稀释血清，为原血清及其10、102、103、104、105、106、107倍稀释血清。用2种试剂分别测定HBVDNA 载量，以确定两种方法的灵敏度。

1.3.1　试剂A　PCR 反应管中加入5μL 核酸释放剂，加入5 μL 标准品、待测标本，吸打混匀，再加入40μLPCR 反应液，吸打混匀上机检测即可。

1.3.2　试剂B　1.5 mL 离心管中加入100μL 标本和30μL浓缩提取液，振荡混匀，12000r/min 离心10 min，弃去上清液，在沉淀中加入30μLDNA 提取液，随后放置100 ℃浴箱或沸水浴10min，12000r/min速度离心10 min，取上清液作为PCR 反应模板，加入分装有PCR 反应液的反应管中上机检测。

1.3.3　质量控制　每个检测批次都包括阴性质控品，HBV 弱阳质控品和HBV 强阳质控品的重复检测。1.4　统计学处理　采用SPSS11.0统计软件进行χ 2 检验。

2　结　　果

2.1　HBVDNA 检测结果比较　在160 份标本中，2 种试剂共同测定阳性158例，共同测定阴性1例，

见表1。对160例标本A、B试剂检测结果进行统计分析，χ 2=0.0135，犘>0.05，2种试剂检测均值差异无统计学意义。表1　　

2种试剂检测阳性率和检测范围比较

试剂A 160 159 99.38 2.6×109 1.5×102 10-7

试剂B 160 158 98.75 2.3×108 8.2×102 10-6

2.2　HBeAg、HBeAb与HBVDNA 定量检测的关系　根据HBeAg、HBeAb检测结果，将患者分为3组，其HBVDNA 定量结果见2。  

各组HBVDNA 定量结果

HBeAg(+) 86 8.3×108 1.2×108

HBeAb组(+) 58 7.5×105 1.8×105HBeAg(-)

HBeAb组(-) 16 4.2×104 1.1×104

3　讨　　论

目前定量检测HBVDNA 的方法有很多种，罗氏试剂检测因具有较高的灵敏度、精密度、可重复性好和较宽的定量范围，被国际公认为PCR 定量方法的参比试剂。由于其成本高、价格贵，在国内大医院或科研机构应用较多，而一般医院仍以国产试剂为主。用于检测HBVDNA 最广泛的方法是采用FQPCR，生产检验试剂的厂家很多，各厂家之间还没有统一的检测标准[89]。本文从临床实验室用户的角度来探讨2种不同厂家的试剂检测结果是否存在差异。A 试剂检测下限为1.28IU/mL，其采用一种全新的免核酸提取的扩增方式，又称 “一步法”病原体核酸荧光定量PCR 检测方法，整个标本处理和检验过程在1 个PCR 反应管中即可完成，且无需离心、振荡、更换离心管等操作，不但简化了操作步骤、节省了耗材成本，而且减少了加热、移液等导致核酸丢失与污染的操作步骤，标本中的核酸全部参与到PCR 反应中，与传统方法比较，每批检测可提前近2h 报告结果。B 试剂采用传统的“浓缩煮沸法”，检测下限为500IU/mL，标本处理包含沉淀、高速离心等过程，核酸容易丢失，获得率低，且步骤繁杂费时。对2种试剂检测160份标本的结果进行比较和相关性分析，发现2种试剂均值差异无统计学意义(犘>0.05)，但从表1可以看出，由于样本处理步骤繁杂，导致核酸的丢失，试剂B结果较试剂A 偏低;同时试剂B有1例1.3×103copy/mL 结果，A 试剂检测为阴性，提示有污染可能。同一份标本用2 种试剂检测，A 试剂的检测值大于B 试剂。以10 倍梯度稀释的乙型肝炎患者阳性血清，考查2种试剂的灵敏度，A 试剂可测至107 倍稀释水平，B 试剂仅可测至106 倍稀释水平，说明A试剂在灵敏度上更高。综上所述，在2种试剂对比中，B 试剂存在纯化标本步骤繁琐、核酸易丢失、获得率低且费时、报告周期长等缺点。而A试剂采用“一步法”免核酸纯化的方法，核酸获得率高，操作简便，并具有很高的灵敏度和准确度，具有较高的临床应用和推广价值。

参考文献

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(收稿日期：20120918)