影响Kleihauer Betke实验结果的实验因素分析
发表时间:2014-04-24 浏览次数:656次
胎母输血综合征(FMH)以胎儿血液通过受损的胎盘进入母体为特征,症状多为非特异性[1];实验室准确检测母血中胎儿红细胞成为临床早期诊断和治疗的基础。KleihauerBetke(KB)实验是最常用的实验室诊断方法[2];但目前国内开展该实验的医院少,相关报道也不多。鉴于此,本研究以新生儿血涂片作为阳性对照,分析不同实验条件对KB 实验结果的影响;并通过回收率实验验证KB实验的准确性,以期更好地应用于临床,避免发生FMH。
1 资料与方法
1.1 一般资料 以2011年4~10月本院妇产科患者作为研究对象;对照组入选标准:(1)尿液HCG 阴性;(2)血红蛋白浓度高于100g/L;(3)红细胞形态正常;(4)年龄25~35岁;实验组入选标准[3]:(1)胎心监护出现正弦样曲线;(2)超声检查发现胎儿水肿,除外胎儿宫内感染、珠蛋白生成障碍性贫血及染色体异常;(3)红细胞形态正常;(4)年龄25~35岁。入选200例未孕患者作为对照组,100 例疑似FMH 患者为实验组。取同血型的脐带血和对照组未孕女性静脉血各1 份,用SYSMEXXT1800i血液分析仪计数其红细胞,然后用生理盐水调节至两者红细胞浓度一致。将脐带血与未孕女性静脉血混合,配制成脐带血百分比含量分别为10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%的混合血样品。
1.2 仪器与试剂 80% 乙醇(分析纯,北京化工厂),1 mol/L枸橼酸(分析纯,北京化工厂),0.2 mol/L 磷酸氢二钠(分析纯,北京化工厂),1% 伊红染液(北京化工厂)。酸性洗脱缓冲液[pH(3.3±0.2)]配制:将12.3 mL0.2 mol/L 磷酸氢二钠与37.7mL0.1 mol/L 枸橼酸混匀。OlympusDP26 数码显微镜。
1.3 方法
1.3.1 血涂片的制备 实验组和对照组的血液均以抗凝静脉血(1.5~2.2 mg/mL EDTAK2 抗凝)或末梢血作为血液来源,按照常规方法推制血涂片。
1.3.2 KB实验 传统实验方法参见《全国临床检验操作规程》中血红蛋白F 酸洗脱实验[4]。在分析其影响因素后对其进行改进:(1)将制备好的血涂片自然干燥10 min 以上;(2)80%乙醇固定5min,水洗待干;(3)将固定后的血膜在37 ℃的酸性缓冲液(0.049 mol/L 磷酸氢二钠,0.075 mol/L 枸橼酸,pH3.3)中洗脱8min,冲洗干燥;(4)在伊红染液中染色60s。水洗待干后,计数1000 个红细胞中胎儿红细胞的百分含量,作为胎儿红细胞染色结果。
1.3.3 KB实验影响因素分析 以脐带血含量为5% 的混合血液为检测样本,每种条件染色20张血涂片,洗脱温度为37、20、10 ℃,洗脱时间为10、8、5、3 min,伊红染色时间为30、60、90、120、150、180s条件下进行KB实验染色。染色结束后,在相同的曝光条件下,采集图像。用ImageProPlus6.0 软件对获取的图像进行积分光密度(IOD)分析,计算胎儿红细胞和成人红细胞的IOD 值;用胎儿红细胞IOD 除以成人红细胞IOD计算IOD 比值。然后计算每种条件下20 张血涂片的IOD 比值均值。以该比值的均值来评价染色效果:比值越大,表明更能有效区分胎儿红细胞和成人红细胞;在分析实验影响因素的基础上分析获得最佳实验条件。
1.3.4 回收率实验 在1.3.3确定的最佳实验条件下,以含不同浓度脐带血的静脉血(10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0%)为检测样本,每份混合血以及不含脐带血的静脉血制备5张血涂片,计算胎儿红细胞百分含量;以静脉血(脐带血含量为0%)的胎儿红细胞的百分含量作为基础百分率,计算回收率:回收率(%)=(测定百分率- 基础百分率)/加样百分率×100。1.3.5 实验组和对照组样品处理 在1.3.3确定的最佳实验条件下检测对照组和实验组患者样品,计算胎儿红细胞百分含量。
1.4 统计学处理 实验结果用SPSS15.0统计学软件进行统计学处理。KB实验影响因素的分析采用方差分析以及狋检验,回收率实验的分析采用直线相关分析,以狓±2.56狊计算95%参考值范围。
2 结 果
2.1 KB实验中洗脱温度、时间对染色结果的影响 染色后胎儿红细胞和成人红细胞IOD 比值见表1。在37 ℃ 8min条件下胎儿红细胞和成人红细胞IOD 比值最大(犘<0.01)。
2.2 KB实验中伊红染色时间对染色结果的影响 将洗脱条件定为37 ℃ 8min,染色30、60、90、120、150sIOD 比值分别为4.12±0.37、10.15±0.87、11.21±0.86、8.23±0.72、6.21 ±1.10、7.15±0.50,在染色60、90s时可获得最佳染色结果,二者间IOD 比值差异不具有统计学意义(犘>0.05),但与其他染色时间IOD 比值比较差异均有统计学意义(犘<0.01)。
2.3 回收率实验 洗脱条件为37 ℃ 8min,伊红染色60s,胎儿红细胞被染成粉红色,折光性强,成人红细胞则呈无色空染状态,折光性差。脐带血与成人静脉血的混合血标本检测结果见表2,脐带血含量与KB 实验结果的相关系数狉=0.999,95%置信区间为0.997~1.000,回收率为84.75%~96.55%。
2.4 实验组和对照组KB实验检测结果 KB 实验检测200例对照组患者中仅有6例患者偶见有深染的胎儿红细胞,故未计算其胎儿红细胞比值以及95%参考值范围。实验组100例患者中,胎儿红细胞占红细胞总数的比值的均值为0.32%,标准差为0.14%,取单侧尾部面积,利用公式狓±2.56狊计算得到实验组参考值范围为小于0.68%。最终临床确诊3 例FMH 患者,KB 实验检测结果为3%、11%、2.6%;低于参考值范围的实验组孕妇无确诊FMH 患者。
3 讨 论
FMH 以胎儿血液通过受损的胎盘进入母体为特征[56],症状多为非特异性,晚期表现为三联征:胎动减少或消失;胎心监护提示典型的正弦曲线图形,胎心基线变异减少,晚期减速;B超检查提示胎儿水肿,胎儿生长受限、死胎。新生儿出生后表现为皮肤苍白[7]、肌张力减低、低Apgar评分、贫血,输血治疗可矫正临床表现。实验室检测母血中胎儿红细胞的含量是对该病确诊的直接证据。
K-B实验具有需要仪器少、适合夜班以及休息日的优点,成为目前主要的检测方法[1,8]。同时该实验具有手工操作多、对操作者经验要求高、缺少质量控制系统等缺点[910],因此如何提高实验稳定性及结果准确性,成为实际工作中亟待解决的问题。
K-B实验的洗脱条件(洗脱时间和洗脱温度)和染色条件是重要影响因素。随着洗脱温度升高,酸性洗脱液的洗脱力度增强,获得最佳实验结果的洗脱时间缩短。在某一温度条件下,随洗脱时间延长,IOD 比值表现为先增大后减小。以37 ℃ 洗脱条件为例,开始时HbA 洗脱速度远高于HbF 洗脱速度,随着洗脱时间延长成人红细胞着色强度降低葡萄球菌的耐药情况严重,青霉素G、红霉素、克林霉素、复方新诺明、头孢类抗生素的耐药率均超过60.00%,提示这些药物已不适合经验性治疗表皮葡萄球菌败血症;表皮葡萄球对利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素较敏感,耐药率均在5.00%以下,可作为治疗表皮葡萄球菌败血症的首选药物。近年来,肠球菌的耐药性愈来愈严重,表现为耐青霉素、高水平耐氨基糖苷类抗生素及耐万古霉素,各地报道的耐万古霉素肠球菌感染有增加的趋势[56]。本研究中虽然未发现耐万古霉素的革兰阳性菌,但是检出2株对替考拉宁耐药的菌株。这应该引起临床医生的注意,严格控制糖肽类抗生素的使用,避免万古霉素的滥用,防止耐药菌株的出现。
本研究中检出真菌18株,占致病菌的9.05%。近年来真菌感染的比例明显升高,这与广谱抗生素、免疫抑制剂、激素的长期使用及患者自身的免疫状况有关。临床医生应该对真菌感染引起足够重视,注意预防院内真菌感染,及时检测真菌感染,严格控制抗生素的使用。本文中检出真菌以马尔尼菲青霉菌和近平滑念珠菌为主,与国内其他文献报道的以白色念珠菌感染为主不同[78],这可能与地域差异和标本送检量有关。7株马尔尼菲青霉菌均来自艾滋病患者血标本,提示临床应重视艾滋病患者真菌感染情况。
综上所述,通过对本院2010 年11 月至2012 年3 月血培养病原菌分布及耐药性的统计分析,可以看出血培养标本检出病原菌种类多、分布广且耐药情况严重。这提示临床医生应重视血培养,根据药敏试验结果合理使用抗菌药物,减少不合理的经验性用药,防止抗菌药物滥用及耐药菌株的产生。另外,医院应该对血培养病原菌的分布和耐药性做好统计工作,帮助临床医生及时掌握病原菌的耐药状况,指导抗菌药物的合理使用。
参考文献
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