LightCycler480Ⅱ型实时荧光定量PCR 仪性能评价

随着PCR 技术的不断发展，该项技术已广泛应用于生命科学的各个领域。HBVDNA 检测对乙型肝炎的临床诊断和 疗效监测及预后起着重要的指导作用[1]。有报道称在临床治疗过程中，如果患者血中HBVDNA 载量下降2 个Log值甚至低于检测下限，说明抗病毒治疗有效;如果患者用药3个月后病毒载量无下降，说明抗病毒治疗无效[2]。因此，检测结果的准确度对临床诊断和科研工作都尤为重要。2012年4月笔者对川北医学院附属医院新引进Roche480 实时荧光定量PCR 仪进行了主要性能指标的评价实验，以此了解该仪器的分析性能和诊断性能，为临床提供可靠的实验数据，现报道如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料　临床标本来源于川北医学院附属医院门诊和住院患者，收集40 例经本院Roche1.2 荧光定量PCR 仪检测，HBVDNA 浓度为103～107IU/mL 的非脂血、溶血的乙型肝炎患者血清标本，分装在已灭菌的1.5mLEP 管内，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2　仪器与试剂

1.2.1　仪器　Roche480 实时荧光定量PCR 仪(Roche 公司)、LightCycler1.2 实时荧光定量PCR 仪(Roche公司)、生物安全柜、恒温金属浴、低温高速离心机等。

1.2.2　试剂　HBV 核酸定量检测试剂盒及HBVDNA 标准品均由上海科华生物工程股份有限公司提供，批号均为20110721。

1.3　方法

1.3.1　精密度实验　按照CLSI文件制定的评价标准，在Roche480实时荧光定量仪上检测4×104、4×106IU/mL 两种浓度的标准血清，完成批内和批间的重复测定。批内精密度实验在相同条件下对同一标本在尽可能短的时间内测定40次;批间精密度实验每天测1次，连续测定40d，分别计算批内和批间的平均值、标准差、变异系数及总变异系数。

1.3.2　准确度实验　取4×104、4×106IU/mL 两种浓度的标准血清各40份，在Roche480实时荧光定量仪上各检测1次，计算其平均值，并分别与标准血清定值相比较，计算相对偏差。

1.3.3　灵敏度实验　分别取4×104、4×103、4×102IU/mL三个浓度的标准血清各40 份，在Roche480 实时荧光定量仪上分别检测1次，根据其阳性检出率判断其灵敏度。

1.3.4　线性测定　分别取4×107、4×106、4×105、4×104、4×103IU/mL 的标准血清，在Roche480上检测1次，将检测值和预测值做直线相关及回归分析得出相关系数和线性方程。

1.3.5　比对实验　根据EP9A 文件的要求，将40 例临床血清标本在两台仪器上进行平行检测，每天测量8个标本，每台仪器每份标本测量2次;第1次测量顺序：为1～8，第2次测量顺序：8～1，两次测量时间间隔大于2h，连续测量5d，取两次测量的平均值作为比对结果，计算其相关性[3]。

1.4　统计学处理　所有计量资料经对数转换后采用Excel2007 软件、SPSS17.0软件进行直线相关及回归分析、配对狋检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　Roche480精密度和准确度　批内变异系数为1.40%～2.10%，批间变异系数为1.17% ～1.40%，总变异系数为1.40% ～1.83%，2种浓度的HBVDNA在Roche480上检测的均符合卫生部标准，见表1。与标准品比较，两个浓度检测结果的准确度为0.35% ～0.41%，符合卫生部标准。

2.2　灵敏度　对HBVDNA 浓度大于或等于4×103IU/mL的标准血清的检出率为100%，对HBVDNA 浓度为4×102IU/mL 检出率为90%。

2.5　比对实验　将40例符合要求的临床实验标本按照上述实验方法进行检测，对两组平均值进行配对狋检验，p=0.113，提示Roche480与Roche1.2 的检测结果差异无统计学意义;其线性比对回归直线方程：y=0.9230x+0.3397(r=0.995)，提示两台仪器具有良好相关性。

3　讨论

近年来荧光定量PCR 技术广泛应用于临床多种病原体的检测[26]。它不仅灵敏度高、特异性好、误差低，而且避免交叉污染和环境污染，在很大程度上弥补了定性PCR 的缺点[5]。Deback等[7]指出，Roche480 型实时荧光定量PCR 仪对测量人巨细胞病毒、EB 病毒、HHV6、BK 病毒负荷是一个灵活的PCR 技术平台。Roche480型实时荧光定量PCR 仪使用宽光谱、高强度的氙灯作为光源，实现最佳的荧光激发效率，采用ThermaBaseTM 热循环技术和先进的光学检测系统，结合独特的散热器和高性能风扇保证散热的快速，确保均一的孔间温度，彻底消除边缘效应。Roche480精密度实验表明，在106IU/mL 数量级和104IU/mL 数量级上值均小于5%，具有较好的精密度，符合卫生部标准。灵敏度方面，Roche480在HBVDNA浓度大于或等于4×103IU/mL 时检出率均为100%，在浓度为4×102IU/mL 时检出率高达90%，而造成假阴性的原因可能与操作过程中不可避免的随机误差及标本本身的因素有关。本实验所用Roche480 与杜琼等[4]提到的ABI7700、ABI7500相比，灵敏度有所提高，提示其在检测临床病原体的检出率较高。线性实验使用涵盖临床上绝大多数阳性标本浓度范围(103～107IU/mL)的5个浓度梯度的标准品，测得其相关系数为0.999，线性方程为y=1.0073x-0.0487，为PCR 定量提供参照标准，使得定量更加准确。按照CLSI的EP9A2 文件要求，比对试验r>0.95为相关良好。本实验中，Roche480与Roche1.2 相比，检测结果的相关系数为0.995，相关性良好;配对狋检验p=0.113，提示两台PCR 仪检测结果差异无统计学意义，均能用于临床标本的检测。综上所述，RocheLightCycler480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪的精密度、准确度、灵敏度均达到卫生部的标准，线性范围较宽，与Roche1.2检测系统有良好的相关性，能满足临床分子生物实验室的要求。

参考文献

[1] 程钢，何蕴韶，周新宇.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒[J].中华医学检验杂志，1999，22(3)：135138.

[2] 曾争，刘丹，公维波，等.三种PCR 仪的特异性及灵敏度评价[J]. ·208· 国际检验医学杂志2013年1月第34卷第2期　IntJLabMed，January2013，Vol.34，No.2医疗卫生装备，2006，27(10)：6163.

[3] 郭华国，姚正国.脂质、血红蛋白、胆红素标本对乙肝病毒DNA 荧光定量测定的影响[J].微循环学杂志，2006，16(1)：3233.

[4] 杜琼，倪滔，刘小琦，等.ABI7700、7500 荧光定量PCR 仪性能评价[J].实用医院临床杂志，2009，6(1)：6364.

[5] CastelainS，DescampsV，ThibaultV，etal.TaqManamplificationsystem withaninternalpositivecontrolforHCV RNAquantitation[J].JClinVirol，2004，31(3)：227234.

[6] BoutolleauD，DebackC，GéliJ，etal.EvaluationoftheLightCycler480realtimePCR system forthe measurementofCMV，EBV，HHV6andBKVviralloadsinwholeblood[J].PatholBiol(Paris)，2010，58(2)：166169.

[7] DebackC，GéliJ，AitArkoubZ，etal.UseoftheRocheLightCycler480systeminaroutinelaboratorysettingformoleculardiagnosisofopportunisticviralinfections：Evaluationon wholebloodspecimensandproficiencypanels[J].JVirolMethods，2009，159(2)：291294.

(收稿日期：20120912)