新生大鼠海马神经干细胞的离体培养及细胞连接的超微结构观察

神经干细胞(NSCs)的发现,为中枢神经系统疾病的治疗带来了新的手段。NSCs是指中枢神经系统中具有自我更新、自我增殖及多向分化潜能的一类细胞[1]。研究表明,胚胎、新生及成年哺乳动物的室管膜下区、海马、纹状体、中脑、臭球和脊髓等部位都存在神经干细胞[2-4]。随着NSCs研究的深入,离体培养的NSCs已经成为常用的一种的基础工具。细胞的形态和结构决定其生物学功能,离体培养的NSCs有着怎样的超微结构,尤其是NSCs之间的细胞间连接是怎样的,是否存在互相交流的结构基础,目前报道较少。本研究在成功分离、培养新生大鼠海马NSCs的基础上,应用透射电镜观察NSCs的超微结构及细胞间连接。为深入研究神经干细胞的生长特性和功能特点提供形态学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物   新生1d SD大鼠,由徐州医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器  DMEM/F12培养基、B27、bFGF和EGF(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青公司),Nestin单克隆抗体(BD公司),多聚赖氨酸、GFAP单克隆抗体和β-Ⅲtubulin单克隆抗体(Sigma公司),FITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司);一次性无菌培养瓶和培养板(corning公司),二氧化碳培养箱(Thermo3111),荧光倒置相差显微镜(Olympus IX-70),超薄切片机(LKB2088),透射电镜(HITACHI H-600)。

1.3 实验方法

1.3.1 神经干细胞的分离培养 取新生1d的SD大鼠,无菌条件下断头取脑,分离海马组织,置于盛有少量高糖DMEM/F12基础培养液的无菌培养皿中;用眼科剪将组织尽量剪碎,加人基础培养液5mL,用巴氏吸管轻柔吹打,400目筛网过滤,制成单细胞悬液,离心去上清液,加人含bFGF(2Oug/L)和EGF(20ug/L)的DMEM/F12完全培养基2mL重悬细胞,台盼蓝染色,细胞计数,以2×105个细胞/L接种到625px2的培养瓶中,置37C、5%CO2、95%空气,平衡湿度培养箱中培养。2~3d换液1次,倒置显微镜观察细胞形态及生长状况。

1.3.2 神经干细胞的鉴定 选取部分培养的克隆球悬液种植于铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中。1h后取部分盖玻片进行Nestin免疫荧光染色,更换为去除生长因子和血清浓度为10%的DMEM/F12培养基继续培养7d后分别进行GFAP和β-Ⅲtubulin免疫荧光染色。

1.3.3 免疫荧光细胞染色  取贴有细胞且到时间点的盖玻片:(1)0,01mmol/L PBS洗,5min×3次;(2)4%多聚甲醛固定,室温15min;(3)10%正常羊血清(含0.1%TritonX-100,室温30min,(4)吸弃血清,分别滴加一抗(Nestin1:500,GFAP1:1000，β-Ⅲtubulin1:800,抗体用含0.1%的TritonX-100的0.1mmol/L  PBS稀释,4℃过夜;(5)FITC标记山羊抗小鼠IgG(1:200),37℃1h。除第(3)步骤之外其余各步完成后均以0.01mmol/L PBs充分冲洗。荧光倒置显微镜下观察、拍照。

1.3.4 透射电镜标本的制作  取原代培养7d的神经干细胞:(l)3000r/min,4℃离心15min后吸去上清,缓慢沿壁加人2.5%的戊二醛,4℃固定3h;(2)将细胞团块移人青霉素小瓶,0.1mmo1/L PBs冲洗3次后,浸泡3h,中间每隔20min换洗l次;(3)1%锇酸后固定2h;(4)双蒸水冲洗3次后,浸泡2h,中间每隔20min换洗1次;(5)梯度乙醇/丙酮脱水,依次加人50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+丙酮、90%丙酮、100%丙酮、无水丙酮(含无水硫酸钠的100%丙酮),每步10min,其中,70%乙醇中含饱和醋酸铀、无水丙酮过两道,(6)618环氧树脂比无水丙酮(1:12h,2:137℃2h,纯树脂37℃2h)置换后纯树脂包埋,(7)修块,(8)超薄切片,片厚50nm;(9)柠檬酸铅染色,常温,10min;(9)透射电镜观察、拍片。

2  结果

2.1 新生大鼠海马神经干细胞的形态学观察 原代培养1d时,神经干细胞克隆球很少,几乎看不到,此时可见到折光性很强的单细胞(图1A)。继续培养3d后,可见到较多克隆球形成,体积大小不尽相同,形态以球形或卵圆形居多(图1B)。培养至7d时,这些克隆球数量进一步增多、体积增大,可见到正在分裂成两个克隆球的状态(图1C)。细胞克隆球经Nestin免疫荧光染色呈强阳性,胞浆着色,整个克隆球呈绿色(图1D)。加人血清诱导分化7d后见多数细胞紧贴培养瓶并伸出长的突起,以克隆球为中心向外周呈放射状排列。对诱导分化的神经干细胞进行GFAP(图1E)及β-Ⅲtubu1in(图1F)免疫荧光染色均阳性。

2.2 透射电镜观察 电镜下观察到细胞间排列较为疏松,相邻胞间有空隙(图2A);大部分神经干细胞胞核较大,胞质较少,核浆比很高,胞质中有少量较幼稚的线粒体、粗面内质网、核糖体等细胞器,偶见脂滴(图2B);可见到少量正处于分裂末期的细胞(图2B);部分处于克隆球内部的细胞出现空泡样变性,有的胞核内可见染色质凝集、边集现象,甚至出现凋亡小体(图2C);少量细胞胞质内可观察到类突触样结构和微丝样结构(图2D)。在电镜下,有些相邻神经干细胞胞膜增厚,细胞间隙变窄,形成特化的连接结构(图2E);而有些神经干细胞细胞间隙相对增宽,胞膜无增厚,并可观察到有胞膜上有类似胞吞/胞吐样的小泡(图2F)。

3  讨论

制各原代培养NCSs单细胞悬液一般常用机械分离法[5-6]和酶消化法[7-8]。在本实验中,作者使用巴氏吸管吹打机械分离法。本课题组前期研究发现,使用酶消化法时,若消化时间短,无法使呈球状生长的细胞团完全分散为单细胞,若延长消化时间,虽能使细胞团分散为单细胞,但会造成大部分细胞死亡,相反,机械分离法细胞的成活率和克隆球的形成率均远高于酶消化法[9]。由此推测是否神经干细胞之间存在着特殊的连接结构,而用酶消化时破坏了这种细胞连接,导致了细胞生长缓慢甚至死亡。

细胞连接分为封闭连接、锚定连接和通讯连接(又分为间隙连接、化学突触和胞间连丝)[10]。细胞连接的体积很小,只有在电镜下才能观察到。间隙连接是相邻细胞间允许细胞问离子,代谢产物和其他信号分子交换的通道。这些细胞间通道由独特的结构单位间隙连接蛋白组成[ll]。在神经系统的发育过程中,间隙连接可以使得发育中细胞间进行信息的相互交换,从而影响到细胞的功能。对细胞的正常增殖和分化起着重要的调控作用。本实验在电镜下发现,相邻两个神经干细胞之间的胞膜出现了增厚,在连接处相邻细胞间有极小的缝隙,在间隙与两层质膜中有少量颗粒并有部分胞膜相互镶嵌,出现了类似间隙连接样结构;有的神经干细胞细胞间隙稍增宽,胞膜无增厚,细胞膜上出现了胞吞/胞吐小泡。细胞内的小分子,如无机盐离子、糖、氨基酸、核苷酸和维生素等有可能通过间隙连接相互传递,同时,这种连接对细胞也是一种保护,当细胞破损时,大量钙离子进人,导致间隙连接关闭,以免正常细胞受到伤害[12]。

总之,本课题组成功分离培养出新生大鼠海马神经干细胞,并通过透射电镜对其进行观察,初步揭示了神经干细胞之间的细胞间连接状态,为神经干细胞的生物学功能的研究提供了一定的形态学依据。至于细胞间连接中是否有类似间隙连接蛋白之类的蛋白、可能会是何种类别的蛋白质,以及对神经干细胞增殖与分化进程的影响如何等,还有待于进一步探索。

参考文献

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