瑞舒伐他汀对心肌梗死后大鼠Periostin蛋白的影响

心肌梗死后心肌肥厚、左室扩张、间质纤维化,导致心室重构,进而使心室功能进一步降低,从而导致心力衰竭发生.鉴于Periostin的病理性促纤维化与血管新生作用,越来越多的研究者已经开始关注它在心血管疾病中的特殊功能。本研究拟在利用瑞舒伐他汀(ROS)调脂以外的作用,观察其对急性心肌梗死(AMI)后Periostin的干预效果,探讨其改善心肌重塑的机制,为利用ROS改善AMI后心肌重塑提供实验依据。

1  材料与方法

1.1 材料 ROS(阿斯利康制药有限公司提供);Periostin兔多克隆抗体(上海萨博生物工程有限公司);SP9000试剂盒(北京中杉生物工程公司);DAB试剂盒(北京中杉生物工程公司);RT-PCR试剂盒(Transgene公司);引物由北京博大泰克公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组 8周龄SD雌性大鼠,体质量250~30Og,由郑州大学实验动物中心提供。按照文献[1]的方法结扎左前降支建立AMI模型。另设假手术组(sham组)15只在相应部位只穿线不结扎。术后每天给予青霉素预防感染,共3d。术后24h将30只AMI大鼠随机分为AMI组(n=15)和ROS组(n=15)。ROS组大鼠每天给予ROS10mg/kg(溶于2mL清水)灌胃,AMI组和Sham组大鼠以2mL清水灌胃。所有实验大鼠均自由饮食。4周后颈椎脱臼法处死动物,摘取心脏,在梗死区沿左心室长轴一分为二,取梗死交界区组织,一部分10%甲醛固定后常规石蜡包埋切片;—部分液氮保存,留做RT-PCR。

1.2.2 Masson染色测定心肌胶原容积分数(CVF)  切片脱蜡至水,改良Masson染色法将胶原纤维染成绿色,将心肌染为红色,在光学显微镜下(×400)随机选择5个视野进行观察,使用图像分析软件(Biosens Digital Imaging System v1.6)进行图像分析,CVF的计算方法为:CVF=胶原面积/总面积。

1.2.3 免疫组化检测心梗交界区Periostin蛋白的表达 免疫组化染色(SP法)的操作步骤按照试剂盒的说明书进行,最后经DAB显色、苏木素复染后,阳染产物胞质呈棕黄色或棕褐色。各组照片应用图像分析软件(Biosens Digital Imaging System v1.6)进行图像分析,随机选5个点测量,然后取平均值。阳性产物强度用图像处理系统灰度值表示。

1.2.4 RT-PCR检测心梗交界区Periostin和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA的表达用Trizol试剂处理梗死交界区心肌组织(约100mg)提取总RNA。使用逆转录酶将8uL总RNA合成cDNA。扩增Periostin序列上游引物:5′-ACT CCG TGT CTT CGT GTA TC-3′,下游引物:5′-CTT TCT TCA TTA GTC ATT CCC T-3′,扩增片段为279bp;扩增TGF-β1序列上游引物:5′-CCC ACT GAT ACG CCT GAG-3′,下游引物:5′-GGT TGT AGA GGG CAA GGA C-3′,扩增片段为469 bp;内参GAPDH序列上游引物:5′-AAG TTC AAC GGC ACA GTC AA-3′,下游引物:5′-TCC ACG ACA TAC TCA GCA CC-3′,扩增片段为128bp。取2uL逆转录产物分别应用各组上下游引物进行PCR扩增。扩增条件如下:94℃预变性2min,1个循环;94℃变性30s,退火30s(Periostin为52℃,TGF-β1为54℃,GAPDH为55℃),72℃延伸2min,共35个循环;72℃总延伸6min。取5uL PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外线投射仪下观察电泳条带,用D140图像记录分析系统进行分析,检测因子mRNA的表达量以检测因子的DNA条带和GAPDH的DNA条带灰度值比值计算。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.O软件进行统计学处理,计量资料以X+S表示,组间比较用弟因素方差分析,以P<O.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 各组胶原容积分数及Periostin蛋白表达的比较 Masson染色结果显示:AMI组大量胶原纤维形成,sham组有极少量胶原纤维形成,ROS组介于两者之间;免疫组化染色结果显示:AMI组大鼠心肌细胞胞质中有大量Periostin表达,ROS组相对减少;AMI组及ROS组CVF、Periostin蛋白均显著高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05),ROS组CVF、Periostin蛋白与AMI组相比均显著降低(P<O.05),见图1及表1。

2.2各组Periostin mRNA表达的比较RT-PCR结果显示,AM1组和ROS组与sham组相比较,TGF-β1及Periostin mRNA的表达均显著增加(P<0.05),ROS组与AMI组相比，TGF-β1及Periostin mRNA的表达均显著减少(P<0.05)，见图2、表2。

3  讨论

心肌梗死后心肌细胞坏死使心肌整体收缩力下降,细胞外基质、胶原纤维网发生异常变化,纤维化的增加使心室的顺应性下降,重塑更趋明显,最终心力衰竭必然会出现。心肌梗死后肾素一血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活,血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)可以刺激成纤维细胞等分泌TGF-β1,引起胶原合成增多,从而促进导致纤维化的发生、发展.体外实验证实,TGF-β1诱导胶原分泌增加,使大鼠心脏成纤维细胞I型、Ⅲ型胶原mRNA表达增高。TGF-β1在体内也刺激细胞外基质蛋白表达,诱导心肌纤维化。

Periostin是一种主要由成纤维细胞分泌的细胞外基质蛋白,在成年正常心肌中不表达,但心脏受到损伤时就会大量表达[2]。最早研究的主要是其在肿瘤病理进程的作用,还有研究报道其在皮肤[3]、肾脏及心脏瓣膜[4]、肌肉损伤等条件下亦有表达。压力负荷、应激、炎症等均可引起骨膜蛋白表达上调。Pehosun蛋白可与胶原I、胶原-V、粘连蛋白等基质蛋白结合参与生理性及病理性纤维化的形成[3]。有研究表明,Pehosun蛋白参与病毒性心肌炎心肌纤维化的发生、发展,并与Ang-Ⅱ及TGF-β1有关[5]。Pchosun蛋白还可通过血管生长调节等途径促进动脉粥样硬化斑块的生长及不稳定性,从而参与冠心病的发生、发展过程[6]。Iekushi等[7]在AMI大鼠中使用缬沙坦治疗后发现,缬沙坦可通过抑制Periostin表达来改善心功能及心肌梗死后心室重塑。李佳或等[6]发现芪苈强心胶囊和雷米普利均能通过降低心肌梗死区Periostin mRNA表达改善心室重构。然而他汀类药物对AM1后心室重构的影响是否也与Periostin信号通路有关,目前仍未见报道。

本研究以检测心肌Pehoson的变化来反映R0S的抗心肌重构作用。结果发现,与AMI组相比,ROS组心肌Pcrlo⒌0n、TG孓β1表达明显降低,胶原容积分数降低。实验结果证实,ROS能够降低梗死交界区心肌Pchoson的表达,可改善AMI后心肌重塑,其机制可能为ROs通过降低TGF u的水平,调节pehos。n的表达,从而减少胶原的沉积,这为治疗AMI后心室重构提供了实验依据,但深人的其他机制尚待进一步探讨。

参考文献

[1]王勇,高大中,殷跃辉. 大鼠心肌梗死模型建立方法选择及心电图表现[J].中国实验动物学报,2011,(06):525-529.

[2]Stansfield WE,Andersen NM,Tang RH. Periostin is a novel factor in cardiac remodeling after experimental and clinical unloading of the failing heart[J].Annals of Thoracic Surgery,2009,(06):1916-1921.

[3]Zhou HM,Wang J,Elliott C. Spatiotemporal expression of Periostin during skin develo pment and incisional wound healing:lessons for human fibrotic scar formation[J].J Cell Commun Signal,2010,(02):99-107.

[4]Norris RA,Moreno-Rodriguez RA,Sugi Y. Periostin regulates atrioventricular valve maturation[J].Developmental Biology,2008,(02):200-213.

[5]吴岚,宋丽君,王朝霞. 骨膜蛋白在实验性病毒性心肌炎小鼠的表达及意义[J].临床儿科杂志,2011,(07):661-664.

[6]杨汆,丁志坚,朱傲霜. 冠心病患者血浆Periostin蛋白与血管内皮生长因子的相关性[J].中国动脉硬化杂志,2011,(02):135-138.

[7]Iekushi K,Taniyama Y,Azuma J. Novel mechanisms of valsartan on the treatment of acute myocardial infarction through inhibition of the antiadhesion molecule Periostin[J].Hypertension,2007,(06):1409-1414.

[8]李徍彧,杨萍. 芪苈强心胶囊对心梗后心力衰竭大鼠Periostin蛋白表达干预作用的研究[J].中国实验诊断学,2009,(02):170-172.