多发性骨髓瘤患者外周血T细胞亚群及细胞免疫功能研究

多发性骨髓瘤(MM)是—种骨髓浆细胞恶性克隆性增生疾病,以血清或尿液中出现单克隆免疫球蛋白或其成分(M蛋白),以及广泛溶骨病变和(或)肾功能损害为特征。研究发现[l],MM患者常伴有明显的免疫功能异常,调节性T细胞(Treg)很可能参与了MM的发病。Treg的表面标志是CD4+.CD25+,主要负调节机体免疫反应,维持自身耐受和防止过度的免疫应答损伤机体,同时能阻止机体对自体同源肿瘤细胞的识别,导致肿瘤免疫逃逸。FOXP3+是Treg特异性表达的转录因子,与Treg的分化、发育和免疫调节功能的发挥密切相关[1],因此很多学者将CD4+CD25+F○XP3+T细胞作为Treg进行研究。为了解MM患者的免疫微环境状态,作者采用流式细胞术检测28例初诊的MM患者及22例健康志愿者外周血T细胞亚群、Treg的比例,并研究MM患者的细胞免疫功能,旨在为MM相关的免疫学机制研究、临床治疗靶点及预后的评估提供更多的依据。

1 资料与方法

1.l 一般资料 以解放军第452医院2008年5月至2010年9月肿瘤血液科初诊的MM患者作为研究组。MM患者的诊断标准参考张之南主编的第3版《血液病诊断及疗效标准》,将其按照2005年国际骨髓瘤工作组提出的最新MM国际分期标准(ISS)进行分期。28例初诊的患者中,I期2例、Ⅱ期6例、Ⅲ期20例;其中男15例,女13例;发病中位年龄62岁。对照组来自本院体检中心”例体检健康者,未发生相关疾病史、家族史,近期无感冒,其中男11例、女11例;中位年龄60岁。

1.2 试剂与材料 淋巴细胞分离液购自美国Modiatech公司;CD3JITC、CD83FITC、CD4FITC、CD25J⒌Cy5、Foxp3PE等抗体购自美国BD公司,洗涤液含1%FBs与01%叠氮钠的磷酸盐缓冲液(PBS)(实验室自行配制),4℃储存;含1%多聚甲醛的PBs(实验室自行配制),4℃储存。流式细胞仪(BD FACSAHa)为美国BD公司产晶,Cell Quc鼓软件分析数据。细胞银染液、固定液及KL型分析系统购自北京健尔康公司。定量ELISA试剂盒购自eBioscience公司。

1.3  T细胞亚群的检测 取50uL抗凝全血加人20ul抗体(CD3+/CD4+/CD8+等抗体)混匀后在室温(25℃)下避光孵育15min,然后加人红细胞裂解液1.5mL,混匀后在室温(2℃)下避光孵育15min,离心(1000r/min,5min),弃上清液再加人1.5mL PBS,混匀后再次离心(1000r/min,5min),弃上清液,上机分析.

1.4  Treg的检测 抽取外周血2mL,加人EDTA抗凝试管中。用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(白膜层),PBS洗涤2次,离心弃上清液,制成单细胞悬液,调整细胞浓度。取100uL加人FCM检测管1号和2号中,然后分别加人20uL CD4FITC、5uL CD2⒌APC,混匀,室温避光孵育15min。然后固定细胞,破膜进行胞内染色,含1%FBS与0.1%叠氮钠的PB洗涤2次,离心弃上清液。加人300mL含含1%多聚甲醛的PBs重悬细胞,4℃避光保存,上机检测

1.5 细胞免疫功能检测 分离MM患者和健康对照者的外周血单个核细胞,将其银染,经KL分析系统计算淋巴细胞银染核仁区(AGNORs)面积与核面积的比值(IS%);应用定量ELISA试剂盒测定M患者和健康对照者血清中Th1/Th2比值(IFN-γ代表Th1,IL1o代表Th2)及转化生长因子(TGF)邗含量(根据试剂盒样品的标准曲线计算)。

1.6 统计学处理 采用SAS9.1.3版医用统计软件分析数据,计量资料以X±s表示,两组间比较采用莎检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.l  MM患者与健康者外周血T细胞亚群比较 初诊MM患者外周血总T细胞(CD3+)比例、辅助/诱导T细胞(CD3+D4+)比例与健康对照组比较,差异无统计学意义(P>,05);初诊患者的抑制/细胞毒T细胞(CD3+CD8+)比例较健康组增高(P(0.05),(CD3+CD4+)/(CD3+CD8+)比值较健康组减少(P(0.05),见表1、图1。

2.2 MM患者与健康者外周血Treg比较 初诊MM患者外周血CD4+CD25+细胞/CD4+细胞、CD4+CD25+FoxP3+细胞/CD4+CD25+细胞明显高于实验组,见表2、图2。

2.3 免疫学指标 经检测,初诊MM患者血清中Th1/Th2比值、AgNORs均明显低于健康组(P<0.05);血清TGΓβ含量较健康组上升(P(0,01),见表3。

3 讨论

MM是一种免疫系统的恶性肿瘤,近年来,随着分子生物学和免疫学的不断进展,其免疫功能异常的相关机制正逐渐被揭示。机体内抗肿瘤应答主要由T细胞执行,其中CD4+细胞主要为辅助性T细胞(TH),可分化为Th1、Th2、Th17三类效应细胞(Th1、Th2分别在细胞免疫和体液免疫中发挥作用,Th17参与固有免疫和某些炎症);而CD8+细胞主要由细胞毒性T细胞和抑制性T细胞(后者尚未分离出独立表面标志)组成。本研究发现,MM初诊患者外周血CD3ˉCD8+较健康者明显增高,并导致CD4/CD8细胞比例失衡,这与既往报道相符[3],提示T细胞亚群比例的紊乱与MM的发生及进展紧密相关。MM患者CD8+T细胞比例异常上升,这些增多的CD8+T细胞很可能不具各正常的抗瘤功能,对瘤细胞处于失活或耐受状态,甚至在机体中发挥着免疫抑制作用。

CD4+CD25+Treg是一群具有免疫抑制性作用的T细胞,在维持对自身机体成分免疫耐受的同时也抑制了机体对自体肿瘤细胞的免疫应答,故Tleg在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。FoxP3+作为Tlcg特异性表达分子,在本研究的初诊骨髓瘤患者中明显高表达,这与杨燕飞[4]的检测结果一致。Tregs能形成将效应细胞转变成抑制细胞的微环境,使一些CD4+CD25+Treg细胞能被Treg诱导并分泌TGF-β或IL-10[5]。Treg在MM患者体内高表达,致使其免疫功能受到抑制,可以尝试通过外界干涉减少Treg的活化,在避免自身免疫性疾病诱发的前提下改善MM患者的免疫状态。

为进一步分析MM患者与健康对照组之间细胞免疫功能的差异,作者选择以下指标进行检测:(1)Th1/TⅡ比值,反映体内抗肿瘤免疫状态;(2)AgNORs,是RNA聚合酶的亚单位,代表rDNA的转录效率,能体现淋巴细胞活性和机体细胞免疫状态[6];(3)TGFβ,由瘤细胞和Trcg共同分泌的免疫抑制因子,可显示肿瘤对免疫应答的抑制程度。经过检测,初诊MM患者血清中Th1/Th2比值、AgN0Rs明显低于健康组,而血清TGFβ含量高于健康组,这提示MM患者体内的瘤细胞和Trcg通过分泌TGF-β等免疫抑制因子,极大地削弱了针对瘤细胞的免疫杀伤(表现在Th1应答向T1方向漂移),降低了机体免疫细胞的活性和功能,导致患者细胞免疫功能不全,为MM的进一步进展提供了有利的微环境[7]。细胞免疫功能紊乱是导致MM发生、发展的重要原因和严重后果。异常的浆细胞不仅能快速增殖,而且能模拟一些免疫系统信号通路有利于肿瘤免疫耐受网络的形成,削弱了免疫治疗和临床常规治疗肿瘤的有效性。骨髓瘤患者即使经常规治疗达完全缓解,仍不能改变其难以治愈的结局。MM患者体内会存在微小残留病灶(MRD)而成为复发的根源,而肿瘤微环境中的Treg构成了肿瘤免疫耐受网络的关键成分,促进了肿瘤的发生、发展。因此,以Tregs为靶点的免疫治疗将为血液肿瘤疾病的治疗提供新的参考。

综上所述,本研究发现MM患者的CD3+CD8+T细胞亚群和Treg比例增高,且FOXP3+在MM患者的CD4+CD25+Trcg细胞表达比例明显增加,同时MM患者整体的细胞免疫功能低于健康人,这提示以Tleg细胞为基础的免疫功能异常在MM的发病过程中发挥着重要作用,但其具体的相关机制尚不清楚,有待进一步研究。

参考文献

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[3]Oken MM,Kay NE. T-cell subpopulations in multiple myeloma:correlation with clinical disease status[J].British Journal of Haematology,1981,(04):629-634.

[4]杨燕飞. 多发性骨髓瘤患者外周血调节性T细胞的表达特点及意义[D].杭州:浙江大学医学院,2007.

[5]Jonuleit H,Schmitt E,Kakirman H. Infectious tolerance:human CD25(+) regulatory T cells convey suppressor activity to conventional CD4(+) T helper cells[J].Journal of Experimental Medicine,2002,(02):255-260.

[6]钟国成,张小玉,孙薏. 抗原致敏DC联合CIK在原发性肝癌的临床应用[J].中国肿瘤临床,2009,(24):1404-1408.

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[8]钟国成,孙薏. 多发性骨髓瘤过继细胞免疫治疗的研究进展[J].华西医学,2011,(12):1805-1809.