己糖激酶及其同工酶与鼻咽癌细胞增殖中的作用研究

鼻咽癌(NPC)是指鼻咽腔侧壁及顶部生长的恶性肿瘤，目前普遍认为NPC发病过程复杂，其发病过程与环境、EB病毒、饮食、遗传等因素有关[1]。目前大部分NPC具有高转移、生长快、恶性程度高、发生部位隐蔽等特点，因此NPC发病途径具有多机制、多阶段的特点，因此通过对NPC发病机制及成因进行分析，对防治NPC具有重要的作用[2]。近年研究指出，糖代谢异常与肿瘤的发病机制具有密切的关系。对己糖激酶及其同工酶与鼻咽癌细胞增殖中的作用机制进行研究，旨在为同类疾病的治疗提供参考指导，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料：选择本院2010年1月～2013年1月收治的鼻咽癌患者30例为研究对象，患者经病理组织学及影像学诊断证实为鼻咽癌，所有患者均行手术治疗且术前没接受放疗、化疗。男18例，女12例，年龄29～76岁，平均(49.6±3.8)岁。患者肿瘤大小0.8～5.9 cm，平均(2.8±1.4)cm。患者病理学分级：G1级10例，G2级12例，G3级8例。患者FIGO(病理组织学)临床分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期7例，Ⅲ期8例，Ⅳ期6例，淋巴结转移12例。患者病理分级及临床分期均符合2000年WHO对鼻咽癌的分级标准。选择同期在行身体检查的健康体检者30例为对照组，男17例，女13例，年龄21～78岁，平均(48.8±4.2)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法：①免疫组化法：采用免疫荧光组化法检测两组鼻黏膜组织中己糖激酶及其同工酶的表达。兔抗人己糖激酶多克隆体购于福州迈新生物技术公司，同工酶鼠抗人多克隆抗体购于北京金桥生物技术公司。以1:150的浓度将兔抗体己糖激酶多克隆体稀释，己糖激酶同工酶鼠抗体多克隆抗为即用型。己糖激酶同工酶采用EDTA热修复处理20 min，己糖激酶采用柠檬酸缓冲液于高压锅中热修复处理2 min后采用冷水洗涤，并采用PBS缓冲液对样品进行冲洗，随后依次在试样板中加入一抗、二抗以及DAB进行显色反应。经苏木精复染后采用乙醇对样本脱水并制成中性树胶封片，并与已知的阳性切片进行对比，阴性对照则采用PBS缓冲液替代一抗的样本进行参照。②PCR方法：采用RT-PCR(购于日本TAKAPA公司)测定各组己糖激酶含量，设计针对人己糖激酶的PCR的探针序列以及荧光检测引物，选择人GAPDH(由美国BD公司提供)作为测试的内参物，并采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取RNA，荧光定量PCR实验严格按照试剂盒操作说明进行。己糖激酶相对表达量=目的基因/内参基因。

1.3免疫组化结果的判断：①己糖激酶阳性表达为棕黄色颗粒见于细胞核内，己糖激酶同工酶阳性表达为棕黄色颗粒见于细胞质及细胞核内。②在倍数为100的显微镜下观察细胞着色情况，根据着色程度由轻至重可分别记为0、1、2、3。随机选取5个视野点，采用倍数为400的显微镜分别对5个视野进行观察，每个视野进行细胞计数，并计算细胞的阳性百分比(以500个细胞作为一组计算单位)，细胞阳性百分率：1为<10%，2为10%～50%，3为>50%。积分计算：①与②计算所得的分值相乘。积分为0分：阴性“-”，1～3分：弱阳性“+”，4～6分：中度阳性“++”，7～9分：强阳性“+++”。

1.4统计学分析：使用SPSS 17.0对各项资料进行统计、分析，各项参数以均数±标准差(s x±)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1己糖激酶的相对表达量：己糖激酶及其同工酶的相对表达量：对照组(0.07±0.04)、Ⅰ期鼻咽癌(1.14±0.21)、Ⅱ期鼻咽癌(1.37±0.27)、Ⅲ期鼻咽癌(1.59±0.34)，Ⅳ期鼻咽癌(1.82±0.41)，两两相比差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

2.2己糖激酶在鼻咽癌中的阳性表达率分析：鼻咽癌组织中己糖激酶及其同工酶阳性表达率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

3讨论

鼻咽癌(NPC)是我国华南地区常见的一种恶性肿瘤，目前其临床的治疗方式就是通过反射治疗。随着近代放疗技术的改进及发展，放疗对癌细胞杀伤力提高的同时也大大降低了对正常组织细胞的损害。尽管如此，但其仍然没法避免对涎腺的损伤，由于对涎腺的质量造成影响，因此导致患者放疗后出现口腔溃疡、口干、咽喉肿痛等症状。同步放疗仍然是目前治疗肿瘤的有效手段，但放疗在杀灭癌细胞的同时也会对正常的组织细胞造成损伤，从而导致患者出现各种不良反应症状[3-4]。老年患者由于机体免疫能力下降，对放疗的耐受程度较差，因此老年人在放疗过程中常出现胃肠反应、骨髓抑制、口腔溃疡以及反射性皮炎等，部分患者由于不良反应症状剧烈而逼迫终止放疗，从而影响患者的治疗效果及生存质量。对鼻咽癌发病机制进行研究可有效提高患者治疗效果，从而为临床用药提供指导，可减少不合理用药对患者造成的不良反应，有利于患者预后。近年相关研究指出，恶性肿瘤患者细胞葡萄糖代谢速度较快，因此患者体内糖酵解的速度将增强，从而使得己糖激酶在肿瘤组织中的聚集度增加，使得己糖激酶摄取量增加，使得己糖激酶表达性增强。因此通过对己糖激酶及其同工酶进行测定能有效观察患者肿瘤进展的情况。随着肿瘤程度的加深，患者体内己糖激酶的表达强度将加强[5-6]。通过本研究发现己糖激酶及其同工酶的相对表达量：对照组(0.07±0.04)、Ⅰ期鼻咽癌(1.14±0.21)、Ⅱ期鼻咽癌(1.37±0.27)、Ⅲ期鼻咽癌(1.59±0.34)，Ⅳ期鼻咽癌(1.82±0.41)，两两相比差异有统计学意义(P<0.05)。鼻咽癌组织中己糖激酶及其同工酶阳性表达率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，从而表现己糖激酶可能参与到鼻咽癌肿瘤的发生及发展过程中，通过测定己糖激酶表达强度对预测鼻咽癌病情有重要的意义。

4参考文献

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