EMMPRIN短发夹RNA对SGC-7901细胞侵袭与迁移的影响

近半个世纪以来，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的常见疾病。据世界卫生组织(World Health Organization , WHO)和美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)估计，全世界每年新发生的癌症患者约为1 000万，病死率为60 % -- 70 07c，约占死亡总人数的12%。在我国，胃癌的发病率和病死率在恶性肿瘤中均居于首位。早期胃癌术后5年生存率为95 % ,晚期胃癌术后5年生存率为70%，两者之间存在较大差异。恶性肿瘤细胞的侵袭和迁移是影响恶性肿瘤患者预后的重要因素。侵袭和迁移是宿主细胞与肿瘤细胞之间相互作用的一个极为复杂的过程，也是恶性肿瘤浸润和转移发生过程中的重要步骤，金属蛋白酶在此过程中起重要作用。跨膜糖蛋白细胞外金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)又称 CD-147，是免疫球蛋白超家族成员，在肿瘤组织中广泛高表达，EMMPRf1V通过诱导基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinase , MMPs)表达而增强对细胞外基质和基膜的降解，进而促进恶性肿瘤的侵袭和迁移;同时，它也可以通过一种旁分泌的方式作用于血管内皮细胞，诱导血管内皮生民因子产生，促进肿瘤血管的增生。本研究构建针对人EMMPRIN短发夹R1VA (short hairpin RNA , shRNA )重组质粒，将其转染SGC-7901细胞，通过测序鉴定及RT-PC 1 i和 W estern blotting筛选出沉默效果显著的十扰质粒，采用Transwell法检测EMMPRf N对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响，为进一步研究EMMl'lillT4对消化道肿瘤的基因治疗奠定基础。

1材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1细胞和载体人胃癌细胞株SGC-7901购自中利院上海细胞库;肠杆菌菌株TOP10和质粒 pGenesil-1由重庆医科一大学附属第一医院向廷秀博士惠赠。

1.1.2主要试剂及工具酶RNAiso Plus，限制性内切酶EcoR I、Hind III、BamH I和TT4 DNA Ligase， RT-PCR试剂盒(大连TaKaRa公司);质粒小量提取试剂盒、无内毒素质粒小量提取试剂盒以及凝胶回收试剂盒(Omega，美国);Opti-MEM培养基、Lipo- fectamine 2000和Matrigel基质胶(Invitrogen，美国); 胎牛血清(杭州四季青生物丁_程材料有限公司);兔抗人EMMPRIN抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2实验方法

1. 2. 1 shRNA的设计与合成以小干扰RNA ( small interfering RNA , siRIVA)的设计原则和GenBank中 EM>t-IPR1N的基因编码序列(NM_ 198589)为依据，利用在线*i RNA设计软件，分别在第765 , 330 , 504和 587位设计4条由21个碱基组成的、iRNA序列，同时设计一条由21个碱基组成的无关序列作为阴性对照组，在TTCG茎环序列构成的发夹结构后连接 siRN A链的反向重复序列，在5’端加人BamH I酶切位点，3’端加人HiT4ad III酶切位点，且3’末端加人转录终止信号TTTTTT。以上序列经BLAST验证，确定均为特异性序列，具体序列见表1。以上5对寡核昔酸链由Invitrogen(上海)公司合成。

1.2.2重组十扰质粒的构建用退火缓冲液将以上5对寡核昔酸链分别溶解，震荡混匀置于95℃水浴箱中5 min后室温中缓慢冷却。限制性内切酶 Hind III和BamH I双酶切pGenesil-1质粒6h，将产物在琼脂糖凝胶(10 g/L)中电泳后用凝胶回收试剂盒进行纯化。在16 0C金属浴中将退火形成的shRNA 和纯化的pGenesil-1用T4 DNA Ligase连接过夜，柱式纯化连接产物后转化感受态大肠杆菌TOP10，将菌液均匀涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，同时以空质粒与TOP10作为对照，37℃空气恒温摇床中培养约12一20 h，挑取单菌落接种于3 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃空气恒温摇床中以200 r/min摇菌扩增，以质粒小量提取试剂盒提取各组干扰质粒，分别命名为pshRNA-EMMPRINI T4pshRNA- MMPRIN2、pshRNA一MMPRIN3、pshRNA-DZMPRIN4和 pshRNA一阴性对照。

1.2.3重组干扰质粒的鉴定①酶切鉴定:将提取的重组质粒pshRNA-EMMPRINI, pshRNA-M1VIPRIN2, pshRNA-MMPRIN3 T4pshRNA-MMPRIN4和 pshRNA一阴性对照与空质粒pGenesil-1用限制性内切酶EcoR I 和Hind III进行双酶切，然后将产物进行琼脂糖凝胶 (I0 g/L)电泳，于凝胶成像仪下观察重组质粒在双酶切后能否出现目的条带。②测序鉴定:将酶切后出现目的条带的干扰质粒送至重庆医科大学感染病重点实验室进行测序。

1.2.4 SGC-7901细胞的培养及转染复苏冻存于一80℃中的SGC-7901细胞，并以1640培养基(含有 10%胎牛血清)置于37℃,COz(50 mL/L)恒温孵箱中培养传至第3代时，将SGC-7901细胞接种到 6孔板上，每孔接种约6. 5 x 10'个细胞，待细胞融合度达80%一90%时，将无内毒素的干扰质粒在脂质体Lipofectamine 2000介导下转染S(>C-7901细胞，井以pGenesil-1 , pshR-VA一阴性对照、aT41H_ o及末处理 SGC-7901细胞作为对照,8组细胞每组转染3孔(脂质体与质粒比例为2.5:1)，在仁述条件卜继续培养 48 h后，置于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋E-C 表达情况。 1.2.5半定量PCR法检测重组干扰质粒对E1TT4TPRIN mliN'.4的沉默效应将上述8组细胞培养48T4:后分别提取总RNA，分别取工林g反转录合成。DN A以 II\CBI中人EMMPRIN mRNA序列为依据，利用引物设计软件()ligo 6. 0和Primer Prcmic:r 5. 0设计 hT41T4IlTPRhIN短片段引物上游引物Pl : 5'-G AT AC"IT4CC'f C ACCTGCTCCTT-3下游引物P2 .5'-CG ACTTC AC AG C CTTC AC'1'C1'-3'，扩增长度为229 by同理没计内参阶actin r_游引物1'3 ; 5'-ACTGTGCCC;T4'1'C'I' \CG EGG-3' 下游引物 P4.5'-GAAAGGGTGTAACG CAACTA-3',打- 增长度为678饰，跨越2个内含子，以上引物均山 TaKaRa(大连)公司合成。所获产物进行琼脂糖凝胶(10 g/ L)电泳〔利用Quantity 0、软件分析各组 EW-IPRRIN及汁actin条带的灰度值并计算I: tT41 M PR1N mRP1N_4的表达率 1. T4. 6 T4''estern blotting法检测重组干扰质粒对 h: IY1 IT4-11' R 1 N蛋白表达的影响将以T4_8组细胞培养 48 h，以4℃PIiS充分洗涤3次后，用细胞裂解液冰匕裂解30 min ,4 0C一下13 000 x g离心5 min，吸取上清液即为各组细胞总蛋白.分别取50 T4g进行SDS- PAGE电泳后转于PV I)E膜，在含脱脂奶粉的封闭液 ( 50 g/L)中封闭4 h，加人兔抗人EMT4'(PPT41N抗体 4℃孵育过夜，1'B Srl'充分漂洗后以H RP标记羊抗兔 IgG 37℃孵育1h，暗室中显影定影暗盒压片后凝胶成像仪拍摄井保存。利用Quantity One软件分析各组 ENIMPRIN及(3-actin条带灰度值，并计算EMMI'1T41N 蛋自的表达率。

1.2.7 Transwell法检测重组干扰质粒对SGC-7901 细胞侵袭和迁移能力的影响选取上述通过半定量 PCR及western blottin。法共同筛选出的沉默效应最明

显的一组干扰质粒，将实验分为pshRNA-EMMPRIN4 转染组、pGenesil-1转染组、psh KNA一阴性对照转染组、ddHzO转染组及未处理SGC-7901细胞组。 )Tran swe11侵袭实验:将SGC-7901细胞接种于 24孔板中，每孔大约接种1. 3 x 105个细胞，每组设 3个复孔，转染(方法同前)后培养24 h。将VlatriT4el 基质胶按I :10比例使用无血清1640稀释后加人置于24孔板的无菌Trans`-ve11内，置于37℃含50 mL/L CO的恒温孵箱2h后,室中加人200 O,L含胎牛血清的1640培养液(10 m1./1)并接种约6 x 10T4个细胞.下室中加人700 p,L含胎牛血清的1640培养液 ( 10 mL/I,)，在恒温孵箱再培养36 h后取出，用棉签将上室细胞尽量擦净，PRS漂洗2次后用40 g/T4多聚f目醛固定15 min，加人结晶紫(10T4/L)染色30 min 后用T4'BS漂洗2次，风干后倒置显微镜下观察并拍照于200倍镜下随机选取5个视野计数穿膜细胞 ②Transwell迁移实验:将SGC-7901细胞接种于 ?4孔板中，每孔大约接种1 . 3 x 105个细胞，每组设 3个复孔，转染(方法同前)后培养24 h将无菌 1'ransivel l置于24孔板中，在卜室中加人200浏J含胎牛血清的1640培养液(10 ml/L)，在下室中加人700 p,L 含胎牛血清的1640培养液(100 ml/L )，各'I`nansicell 接种约6x10;个细胞，将细胞置于37℃含50 mL/L C0,的J巨温孵箱中培养30 1，后取出，染色(方法同前)，倒置显微镜观察穿膜细胞并拍照。

1.3统计学方法 采用SPSS 17. 0软件对数据进行统计学分析计量数据以.x士、表示，组间比较采川单因素方差分析(One-wav- T41NOVA ) T4 P < 0. OS表示差异有统讨一学意义

2结果

2. 1重组干扰质粒的鉴定 将重组干扰质粒与pGenesil-1的酶切产物进行琼脂糖凝胶(10郭侧电泳后于凝胶成像仪下观察，发现各组干扰质粒在396 by位置有一条带，pGenesi L-1 条带出现于364 by位置(图1)，说明重组干扰质粒构建成功。测序分析提示所插人的、hRhN:T4序列不仅米发生突变而且位置正确，进一步证实干扰质粒构建成功。

2. 2绿色荧光蛋白在重组干扰质粒转染SGC-7901 细胞中的表达 转染48 h后，干扰质粒转染组和pGenesil-1转染组SGC-7901细胞均可见到绿色荧光蛋白表达 (图2)，而ddHT4 0转染组及未处理SGC-7901细胞则未见绿色荧光蛋白表达，证明干扰质粒和pGenesil-1 均成功转染进人SGC-7901细胞中并有表达。

2. 3重组千扰质粒对转染细胞E1'TMPRIN mRN A的沉默效果 将以上各组PCR短片段产物进行1 rlc琼脂糖凝胶电泳(图3)，各组转染细胞Ell'TIIPRIN mRN_4的表达率见表1。与其他各组比较，pshRNA-EVIIVIPRIN3转染组和pshRNA一卜:'T411T41PRIN4转染组的ET4TI'IPRIN mRN-T4表达率均显著降低，差异有统计学意义(P

3讨论

近半个世纪以来，随着人类生存环境污染的加重和人们日渐增大的生存压力，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的常见疾病之一。在我国，胃癌的发病率及病死率在恶性肿瘤中均居于首位。胃癌发生于胃豁膜上皮，占胃恶性肿瘤的95%以土胃癌的发生、发展、侵袭及迁移是一个复杂的过程，其中各个阶段又彼此相互交替、渗透，参杂了多种因素和多个基因变异的共同作用。

侵袭和迁移是恶性肿瘤重要的生物学特征之一，也是影响患者预后的重要因素。侵袭和迁移是宿主细胞与肿瘤细胞相互作用的一个极为复杂的过程，包括信号转导、酶类及基因的作用，其中基膜与细胞外基质的降解是恶性肿瘤浸润及转移的重要环节。它与肿瘤的勃附、增殖、运动、对细胞外基质和基膜的降解能力以及与肿瘤组织血管生成能力密切相关，也是胃癌浸润和转移发生过程中的重要步骤，而金属蛋白酶在此过程中起重要作用。因此，及时有效地降低甚至阻断胃癌浸润和转移成为胃癌治疗的关键。

作为免疫球蛋白超家族成员之一，跨膜糖蛋白 EMMPRIN基因定位于19p13. 3 , mRNA为1 676 bp, 其CDS区编码269个氨基酸，由8个外显子组成;其穿膜区由24个氨基酸组成，形成典型的亮氨酸拉链结构，胞内结构域由C端的39个氨基酸组成，胞外结构域由185个氨基酸组成。

生理状态下EMMPRIN仅在上皮细胞、生殖细胞、左心室心肌细胞及脑血管内皮细胞有少量表达’，广泛参与许多生理功能，如胚胎以及器官形态的发生、骨质重建及伤口愈合等m，同时还参与许多病理过程，如呼吸、循环系统疾病、关节炎及溃疡等3。研究4，5证实，在各种器官的不同病理过程中，EMMPFIN的表达与各种MRT4IPs的表达显著相关。研究6,7」还发现，在急性心肌梗死后的心室重塑过程中，左心室心肌细胞中的EMMPRIN和MMP2, MMP9的表达均有增强;也有学者〔R〕观察到在动脉粥样硬化中EMIT4T4TPRiN表达的增加可能与斑块的不稳定性有关。在肿瘤组织中EMMPRIN广泛高表达，它是MMPs的诱导剂，通过诱导MMP*的表达增强对细胞外基质和基膜的降解，从而促进恶性肿瘤的侵袭和转移。近年来，许多免疫组织化学研究9一‘2一显示， EMMPRIN可能参与了许多不同种类肿瘤的生长及预后，如肝细胞癌、宫颈癌、肺腺癌和肾癌。有研究!,3表明，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和双调蛋白(amphiregulin , AR)能通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR) 酪氨酸蛋白激酶的激活途径诱导EMMPRIN的表达，同时EGF和AR的反义cDNA可以下调EMMPRIN 的表达和MMP活性。EMMPRIN不仅能够刺激成纤维细胞表达MMPs，同时它也可以通过旁分泌的方式作用于血管内皮细胞，通过诱导血管内皮生长因子的产生来促进肿瘤血管的增生。另外，EMMPRIN还能通过激活尿激酶型纤溶酶原激活物促进肿瘤细胞浸润〔14J，并凭借Akt信号提高血管内皮细胞生长因子的表达，刺激肿瘤血管生成’sT4。另有研究!T4fi’表明，EMMPRIN在胃癌中的表达水平与微血管密度 ( micro-vascular density , MVD)呈显著正相关，EMMPRIN 的高表达可促进胃癌的发展和浸润。同时，EMMPRIN 在胃肠道癌中的高表达一也促进了癌细胞的增殖和肝转移[m.。 基因沉寂(gene silencing)是指真核细胞生物体中某种基因由于各种原因不表达或表达减少，从而导致相应所翻译的蛋白质量减少。基因沉寂在分子水平上分为两大类:一种是转录水平上的基因沉寂，包括异染色质化、DNA甲基化及重复序列等;另一种则是发生在转录之后的基因沉寂，包括RNA干扰、共抑制和基因压制等。本研究利用一种、hRNA十扰分子，其包含两个由一个小环序列所分隔的短反向重复序列，由Pol III启动子控制，其中一个反向重复序列与目的基因互补。shP.N A随后在体内被加_「成 siRNA，与目的基因的mRNA结合，使得该mRNA被细胞移除分解从而降低mRN A和蛋白质的表达量，属于转录水平上的基因沉寂。该技术方法有体外化学合成法、体外转录法及体内载体合成法，本研究采用的是体内载体合成法，该技术与其他两种方法相比操作简便，成本较低，且导人细胞后更加稳定且效率较高‘sT4，故成为近年较热门的技术。经过RNase )II内切酶Dicer的识别、结合及酶切作用产生21- 23 by的、iRNA，与匹配的mRNA中的特异性序列结合并使其特异性降解，从而降低目的基因mRN.4的表达〔Is.197。有研究一zo,T4l〕证实，利用RNA干扰降低 EMMPRIN基因表达可以减少癌细胞增殖以及降低癌细胞的恶性程度。

本实验研究通过体外合成针刘一人EMMPRIN的 siRNA经退火形成发夹结构shRNA，以pGenesil-1质粒为载体转染SGC-7901细胞，并借助测序、RT-PCR 及Western blotting两种方法选出沉寂效果最明显的干扰质粒组，成功构建并筛选出pshRNA-EMM PRIM 干扰质粒，将其转染SGC-7901细胞后，可降低 EMMPRIN的表达，从而使胃癌细胞侵袭及迁移能力明显减弱。经Transwell实验观察到EMMPRIN干扰质粒转染的SGC-7901细胞组的侵袭和迁移能力明显降低，为进一步研究EMMPRIN对消化道肿瘤的基因治疗提供新的思路。

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