新型纳米非病毒基因输送体系PCL-PEG-chitosan的构建与特性

壳聚糖( chitosan)是一种天然来源的高分子化合物，因具有良好的生物相容性而被运用于药物的控制释放和组织工程研究领域;而作为非病毒载体， chitosan在基因治疗领域的研究一也一自备受关注。然而，由于在体内外对许多细胞系的转染效率一直不是卜分理想，与阳离子脂质体还存在一定的差距已有研究‘表明，由于、hitosar，较强的带电性可导致其与D}a的相互吸引较为紧密，很有可能抑制D};} 在细胞质中的释放，从而降低转染效率，抑制外源基因的转录与表达。因此，在对质粒的复合能力与释放能力上如何取得平衡，已成为非病毒基因载体trJ( 发的热点问题之一2 聚己内醋( polycaprolactone, PCL)是一种疏水基团，它的修饰会在一定程度上降低载体复合质粒的能力，提高载体释放质粒的能力聚乙二醇( poll etly _ lene g卜coI,PEG)具有的较好亲水性、电中性和空间结构惰性，不仅能够减弱调理作用，减少血俭的形成，还能减小复合物的粒径，增加复合物在血液循环中的循环时间止3·4。本课题组在以相对分子质量为 150 000的chi}osan'} chitosan ( 150 000 )〕作为母体材料合成PCL-PEG-chitosa}。的基础上5，进一步验证 PCr,-PEG-chitosan复合DNA的能力，检测载体DN 1 复合物的粒径变化情况及对[DNA的输送能力。

材料与方法

1. 1质粒pEGFP的转化和扩增

1.1.1质}}. p EGFP的转化将1 p,(, pEGFP质粒(3 5 ng/p,L)(购自rnvil}-ogen公司，本实验室常规保存扩增)加人100 p,L感受态菌DHScx，混匀，静置在冰上 30 min，将感受态菌DHS。放人42℃的水浴锅中，热激I. 5 min后立刻将感受态菌DHS。置于冰上冷却 3 -- 5 min，最后将感受态菌涂于含有氨节抗生素的琼脂培养板土.放置摇床过夜(37 0G , 300 r/min, 12一16 h)。

1. 1. 2质粒pEGFP的扩增从琼脂培养板中挑取克隆后，放人含有氨节抗生素的LB培养基中(氨节抗生素终浓度:100 p,g/mL)，放人摇床(37 0C , 300 r/min，12一16 h)。

1.2质粒pEGFP的提纯 收集菌液离心(4 0C ,6 000 xg,15 min)，使用 Qiagen大抽试剂盒，加人10 mL P1重悬菌液沉淀后，再加人10 mL P2 ,摇晃混匀4一6次，室温(15℃- 25℃)静置5 min。加人10 mL预冷的P3，立刻摇晃混匀4一6次，在冰上孵育20 min:离心(4 0C , 20 000 x g , 30 min)后将上清吸至另一个抽提离心管中;再离心(4 0C , 20 000 x g , 30 min)后取上清利用10 mL QB1'平衡Qiagen-tip500质粒吸附柱，然后将上清加人到吸附柱过滤过滤之后，弃去滤液，再用30 ml. QC对吸附柱过柱清洗2遍。弃去滤过的清洗液QC，加入15 mL QF对质粒进行洗脱，收集洗脱液后，加人10. 5 mL异丙醇，混匀离心(4℃， 15 000 x g , 30 min)小心弃去上清，收集质粒沉淀后再用5 mL 70%乙醇重悬质粒沉淀，室温离心 (15000xg,10 min)得到质粒沉淀后室温风千 5一10 min ,再用TE缓冲液溶解质粒沉淀，利用紫外分光光度仪测量浓度和纯度，将提纯的pEGFP置于 - 20℃冰箱内保存纯度:U ( 260 nm ) /D ( 280 nm ) 控制在1. 6一1.8

1.3 chitosan及其衍生物与pF:GFP的复合及复合条件的确定 将chitosan(150 000)、PCL一〔hitosan、PC L-P E G- chitosan溶解在1 07c醋酸溶液中，溶解过程需要用磁转搅拌过夜，然后用0. 2 p,n，孔径的滤头进行过滤、储存(储存液质量浓度为1 p,g/时)用pH 5.4的醋酸盐缓冲溶液分别对储存液进行稀释，按照犯:l, 16:1,8:1,4:1,2:卜1:1设置6个氮磷比(\I/P:指在 cbitosan中有效氮原子含量与D 1} _}1「}，有效磷原子含量的比值)不同的组别。N'/P与质量比的换算关系为:\}/P =2 x质量比在每一个组别中，需要保证组内质粒的含量均为0. 5 O,g，即1 },L加人1 }L pEGEP 后，根据不同的N/P加人不同体积的chitosan (150 000), PCL-chitosan , PGL-1'EG-chitosan进行复合，复合时一需要反复吹打混匀，然后在振荡器上震荡20 s，在室温下静置30 min。用}H 5. 4的醋酸盐缓冲溶液将体系补齐至10 },L。加人6 x loading buffer 2 },L反复吹打混匀，将样品加人事先配置好的1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析电泳条件:100 V , 30 min。电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统室中成像并摄片。

1.4 chitosa。及其衍生物与pEGFP组成复合物的粒径测试 将pEGFP用醋酸盐缓冲液稀释到0.2 }g/},L. 100 },L备用将1 },y/}L的chitosan ( 150 000 ) , PCL-chitosan, PGL-PEG-chitosan分别根据3个N}/P (32:1,16:1,8:1)用醋酸盐缓冲液稀释至100 },I备用。在室温下，将载体缓慢滴加至质粒中，边滴加边震荡混匀。复合完成后，室温下静置30 min，再分别用醋酸盐缓冲液(pH 5. 4)和DMEM ( pH 7. 4稀释至 1.5 mL,稀释过程同样缓慢滴加，混匀后室温静置 30 min ,吸取1 mL样品，采用动态光散射技术测量复合物的粒径

1.5 chitosan及其衍生物与pEGFP组成复合物的转染效率观察 将293 T细胞以2 x 105/孔，每孔1 rnL接种于 12孔板。种板24 h后，细胞密度接近90%以上，将培养基弃去.用PBS清洗一遍后加人转染液。根据前期实验结果，发现在N/P为32:1时复合物有较为合适转染的粒径，因而本实验中的伙/l”选择为32:} 分别将0.2 }g/},L的质粒10时与N/P为32:1的 10 N L chitosan(150 000)、PCL一chitosan、PGL-PEG-chitosan进行复合，在振荡器上以最高速度震荡20 s 后室温下静置30 min，再加人1 m I_无血清培养基 DMFM,混匀，静置5 min后可用转染41:后，将转染液弃去，加人新鲜的含有10%胎牛血清和1%体积双抗的DMEM 1 mL,48 1:后在荧光显微镜下观察转染效率。

2结果

2. 1凝胶电泳确定的最小复合N/P 凝胶电泳结果(图1)显示:在最右侧的7号泳道，裸质粒组的质粒DN在电场作用下迁移离开了加样孔，在PC L-chitosan组的第5和第6泳道以及 PCL-1?EG-chitosan组的第5和第6泳道也可观察到 l司样的现象;而在chitosan组第1 }G泳道，质粒DVS 都被滞留在了加样孔内，提示质粒D1}A被完全复合。由此可见，chilosat:组的最小复合\/P为1:l, PCL-chitosan的最小复合N/P为4 : I , PCL-PEG- chi}osan的最小复合N/P为4:1 2. 2复合物粒径测定结果 动态光散射仪测量结果显示:当N/P增大时， chitosan、PCL一。hitosan、PC I,-PEG一chitosan与pEGFP 组成复合物的粒径减小;当复合物形成后，用DME1}1 对复合物进行稀释对其粒径无明显影响(图2)}

2. 3复合物的转染效率 复合物转染293 T细胞48 h后荧光显微镜下观察发现，PCL-chitosan组的转染效率高于chitosan组， PCL-PEG-chitosan组的转染效率高于PCL-chitosan组和 chiCosan组(图3)，但转染效率仍不够理想，尚需进一步改进。

3讨论 安全性和有效性是基因治疗两大永恒的主题，两者很难达到统一，既安全又有效的基因输送载体已成为基因(分子)治疗走向临床的瓶颈问题。除了安全性和有效性，大规模生产以及成本也是需要考虑的问题。基因输送体系基本可以分成两大类:即病毒基因输送体系和非病毒基因输送体系。病毒基因输送体系利用其天然的高感染特性可以有效地感染细胞;然而，在安全性方面还有不足，如较高的免疫原性、细胞毒性及致瘤性却限制了它们的临床运用。因此，非病毒基因输送体系的研发一直是相关领域研究的热点。

chitosan是一种直链的多糖，由随机分配的p- (1 ,4)糖昔键连接的右旋葡糖胺和N一乙酞右旋葡糖胺单元组成的高分子化合物，它被认为是一种具有潜力的作病毒基因载体，具有优越的生物相容性和生物可降解性以及较低的细胞毒性，而较低的转染效率则影响了它的临床运用[fi。近年来，材料学专家们正在通过化学修饰的方法对chitosan这种天然高分子化学物进行改性以提高其转染效率7,R 随着研究的深人，对于chitosan/DNA复合物进人到细胞核的过程一也愈发清晰。在外源性DNA最终表达之前，需要通过以下7个步骤:复合、体内给药、细胞内吞、内吞溶酶体逃逸、DNA释放、胞质运输和人核，其中每一步都有很多因素会影响到chitosan/DN A 复合物的转染效率，包括chitosan的去乙酞度和相对分子质量「y.io、复合环境的pH值〔m ,}z}、chitosan同 DNA复合时的氮磷比’3以及细胞种类等都会影响复合物的转染效率。此外，对chitosan利用亲水、疏水、pH敏感型、温度敏感型以及细胞特异性基团进行修饰也同样对转染过程具有重要作用〔’4。

在本研究中，我们对〔hitosan进行了PCL及PEG 修饰，构建了新型纳米非病毒基因输送体系PCL- PEG-chitosan，首次在体外对其与质粒的复合物的制备条件进行了优化，并评估了PCL-PEG-chitosan作为非病毒基因载体的可能性，通过凝胶电泳实验确定了chitosan ( 150 000 ) , PCL-chitosan, PCL-PEG- chitosan与pEGFP的最低复合N/P。研究发现PCL 修饰确实能够通过其疏水特性减弱载体与质粒的复合能力，提高载体与质粒复合的最低N/P;而PEG修饰则不会影响载体与质粒复合的最小N/P} 在粒径测试实验中，我们发现chitosan (150 000)、 PCL-chitosan, PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合得到的复合物的粒径会随着N/P的升高而降低。这主要是由于载体材料的增加会通过静电吸引使得质粒的构象变得更为紧密。研究还发现，PCL修饰会在一定程度上使复合物的粒径增大，这也证明了疏水基团确实在一定程度上会减弱载体与质粒的相互吸引，增大粒径;而PEG修饰则可以在载体与质粒相互作用减弱的情况下，使得增大的粒径减小，且比 chitosan (150 000)组的粒径更小。已有研究[is〕发现，PEG修饰对于复合物在生理pH和生理离子浓度条件下的稳定和粒径减小有帮助。

在复合物转染实验中，我们发现经PCL修饰的 PCL-chitosan组转染效率高于未修饰chitosan组; PCL-PEG双修饰后，PCL-PEG-chitosan组的转染效率显著高于PCL-chitosan组和。hitosan组，但转染效率仍不够理想。究其原因可能是由于相对分子质量高的chitosan及其衍生物必须在酸性条件下才能溶解，本实验转染体系为pHS. 4的酸性环境;而酸性条件会影响细胞生存状态，显微镜下观察可见细胞边界轮廓比较模糊，细胞发生皱缩;因此，合成相对分子质量低的chitosan及其衍生物是下一步的发展方向。另外，可能是因为chitosan及其衍生物与pEGFP组成的复合物过于稳定，影响了p F GF'P的释放。因此，在chitosan修饰过程中，寻找复合物稳定性和载体释放。NA能力之间的平衡是一个需重点解决的问题。

综上所述，chitosan因其优越的生物相容性和生物可降解性以及较低的细胞毒性，被认为是一种具有潜力的非病毒基因载体，但同时它较低的转染效率也限制了临床运用，通过化学修饰的方法对 chitosan这种天然高分子化学物进行改性以提高其转染效率是可行的。在这个过程中，需要生物学家和医学家们对基因输送的路径及机制进一步阐明，同时需要材料学家们根据不同靶细胞的生物学特性，设计出特异性化学修饰和改性的方法来对载体进行改良，材料学家、生物学家和医学家刘于此类课题的联合研究将使分子生物学在临床上的应用成为可能。

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