过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响

生物体普遍存在调控生命活动约为24 h的近日节律[1]。mPer1为近日节律振荡器的核心组件，mPer1转录产物的磷酸化和入核在近日节律的产生和调控中起重要作用。Period1(PER1)是近日节律系统中的核心蛋白,并且与机体其他功能诸如药物依赖、肿瘤发生等[2-3]密切相关。Gnb2l1是一个看家基因，在细胞接受刺激的时候，Gnb2l1基因能够迅速作出反应，编码合成RACK1蛋白，实现基因的转录调控以及转录后水平调控，并进一步引发一系列迟发反应。前期研究表明RACK1蛋白为PER1相互作用的节律相关蛋白，上调及下调PER1基因并未影响RACK1的基因转录和蛋白表达[4]。因此推测RACK1并非PER1的下游钟控蛋白，RACK1可能通过参与/介导PER1相关的信号分子通路，进而影响PER1节律及其他功能的实现。因此本文研究过表达Gnb2l1发现mPer1表达量明显增高，可以推测Gnb2l1可能是mPer1的上游钟控基因。进一步揭示生物节律信号通路的分子机制、研究RACK1与PER1的功能联系提供了基础。

1 材料与方法　　

1.1 细胞株 NIH3T3细胞由华西医学中心微生物教研室馈赠。　　

1.2 试剂 DMEM培养基(Hyclone)，小牛血清(Hyclone)，青霉素(华北制药厂)，链霉素(华北制药厂)，胰蛋白酶(宝信生物公司)，PMA(phorboll 2myristate 1 3acetate，Promega)，Trizol(Invitrogen)，RTPCR一步法试剂盒(Takara)，TaqDNA polymerase(Tiangen)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，质粒抽提试剂盒(GIAGENE)。　　

1.3 细胞培养及诱导 细胞于含10%小牛血清、100U·ml-1青霉素及100 U·ml-1链霉素的DMEM 培养基中，5%CO2孵箱内37℃静置培养。NIH3T3细胞按每孔2×105个细胞接种于十二孔板，待细胞12h贴壁后，更换新鲜培养基(每孔1.98ml)，每孔加PMA 20μl，终浓度为100 nm·L-1。　　

1.4 转染 PMA刺激24h后，按照脂质体LipofectamineTX 2000说明书，将pCDNA3.1/Gnb2l1质粒转染NIH3T3细胞(A组)，以pCDNA3.1/vector质粒转染细胞为对照(B组)。转染12h后，每隔2h分别收集实验组和对照组细胞各3孔，共收集48h，24个时间点。　　

1.5 RPCR检测Gnb2l1， mPer1的表达 Trizol法提取细胞总RNA，采用半定量RTPCR法特异性扩增Gnb2l1和mPer1mRNA，分别与内参积分光密度(OD)值相比来分析Gnb2l1和mPer1mRNA相对表达水平。引物由Invitrogen 公司合成。　　

1.6 统计分析 实验结果以(x±s)表示。采用T检验进行比较，以P<0.05为差异具有 统计学意义。　　

2 结果　　

2.1 过表达效率的鉴定　　

RTPCR产物电泳结果。用GelPro Analyzer软件，分析Gnb2l1及βactin，经RTPCR所得条带的(OD)值，计算Rtime=ODGnb2l1/ODβactin。可以看出实验组的Gnb2l1表达量比对照组明显增高(p<0.05)。　　　　

2.2 RTPCR测定过表达Gnb2l1基因对节律基因mPer1表达的影响,表达Gnb2l1基因转染后可导致节律基因mPer1表达显著性增高。可以看出ZT8，ZT11和ZT12的作用更显著，其余的时间点普遍A组比B组高。　　

2.3 余弦法分析mPer1的表达周期　　

用余弦法分析，典型的结果。结果显示实验组(A组)的mPer1表达中值比对照组(B组)明显增高，但mPer1表达的振幅和相位，A组与B组的并无明显差别(p>0.05)。　　

3 讨论　　

Gnb2l1是一个看家基因，在正常细胞中它编码合成RACK1蛋白。RACK1蛋白作为胞内重要的骨架蛋白、接头蛋白、锚定蛋白[5-11]，参与细胞内信号分子复合物生成、影响活性分子亚细胞定位、沟通不同信号通路之间的联系，从而发挥其对于信号转导、基因表达、细胞增殖分化等各方面的调节作用，因此研究者普遍认为RACK1参与了生物体许多重要的生理过程。在神经科学研究中，RACK1蛋白是一个非常重要而活跃的研究领域，神经系统的RACK1功能具有相当的复杂性[12-15]。　　

mPer1在近日节律钟控系统中处于核心地位。目前研究发现PER1主要通过PAS结构域介导蛋白间相互作用而发挥生理功能，但其确切机制尚不清楚。RACK1 作为胞内接头蛋白， 介导了PKC、PKA等信号通路及其之间的联系，上述信号通路已证实在近日节律输入输出通路中发挥着重要作用。前期研究发现，RACK1与PER1蛋白的细胞内分布改变有关，提示RACK1可能介导了PER1的细胞内转位、入核。RACK1与PER1的结合也可能并非意味着RACK1直接介导PER1功能，而提示RACK1以桥接分子的形式和PER1结合，并通过将PER1与其他活性分子(诸如受体，蛋白激酶，细胞因子，转录因子等)相联系而参与PER1相关功能实现(诸如PER1从胞浆转位到核周以及PER1分子对于近日节律基因的转录翻译调控等)。　　

本实验通过转基因技术将外源基因Gnb2l1转染入NIH3T3细胞，用RTPCR技术检测Gnb2l1和mPer1mRNA表达水平，结果显示过表达Gnb2l1能够诱导mPer1表达量的增加。 余弦分析亦显示过表达Gnb2l1导致mPer1表达的调整中值升高，提示Gnb2l1可能是mPer1的上游钟控基因。　　

本研究进一步完善近日节律的分子机制，而且对生物节律相关疾病的发病机制乃至治疗的研究提供新的思路和方向。但是Gnb2l1与mPer1的相互作用非常复杂，如要明确之间的作用机制还需进一步深入研究。

【参考文献】 　

1. Harmer SL, Panda S, Kay SA. Molecular bases of circadian rhythms[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2001, 17(11) : 215-253. 　　

2. Abarca C, Albrecht U, Spanagel R. Cocaine sensitization and reward are under the influence of circadian gene sand rhythm [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(13): 9026-9030. 　　

3. Fu L, Lee CC. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3 (5): 350-361. 　　

4. 鲁芳,胡丽娟,汪宇辉,等. hPeriod1_(PAS)结构域相互作用蛋白的筛选和研究[J].航天医学与医学工程, 2006, 19 (4) : 246-247. 　　

5. Guillemot F, Billault A, Auffray C. Physical linkage of a guanine nucleotidebinding proteinrelated gene to the chicken major histocompatibility complex[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(12): 4594-4598. 　　

6. Park HY, Wu H, Killoran CE, et al. The receptor for activated CkinaseI (RACKI) anchors activated PKCbeta on melanosomes[J]. J Cell Sci, 2004, 117(16): 3659-68. 　　

7. Mamidipudi V, Zhang J, Lee KC, et al. RACK1 regulates G1/S progression by suppressing Src kinase activity[J]. Mol Cell Biol, 2004,24(15): 6788-6798. 　　

8. Besson A, Wilson TL, Yong VW, et al. The anchoring protein RACK1 links protein kinase Cepsilon to integrin beta chains Requirements for adhesion and motility[J]. J Biol Chem, 2002，277(24): 22073-22084. 　　

9. Yarwood SJ, Steele MR, Scotland G, et al. The RACK1 signaling scaffold protein selectively interacts with the cAMPspecific phosphodiesterase PDE4D5 isoform[J]. J Biol Chem, 1999, 274(21): 14909-14917. 　　

10. Sacheva A, Smith R, Minshall R, et al. The WD motifcontaining protein receptor for activated protein kinase C (RACK1) is required for recruitment and activation of signal transducer and activator of transcription 1 through the type I interferon receptor[J]. J Biol Chem, 2001, 276(25): 22948-22953. 　　

11. Ermanto U, Zong CS, Li W, et al. RACK1, an insulinlike growth factor I (IGFI) receptorinteracting protein, modulates IGFIdependent integrin signaling and promotes cell spreading and contact with extracellular matrix[J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(7): 2345-2365. 　　

12. Elcher JC, Weeber EJ, Varga AW, et al. Protein kinase signal transduction cascades in mammalian associative conditioning[J]. Neuroscientist, 2002, 8(2): 122-131. 　　

13.Matsushima H, Shimohama S, Chachin M, et al. Ca2-dependent and Ca2-independent protein kinase C changes in the brain of patients with Alzheimer's disease[J]. J Neurochem, 1996, 67(1): 317-323. 14.Battaini F, Pascale A, Paoletti R, et al. The role of anchoring protein RACK1 in PKC activation in the ageing rat brain[J]. Trends Neurosci, 1997, 20(19): 410-415. 　　

15Tanaka C, Nishizuka Y. The protein kinase C family for neuronal signaling[J]. Annu Rev Neurosci, 1994, 17: 551–567.