Clock基因对雄性小鼠生殖功能影响

自然界中，近日节律基因广泛存在于生物体内，调控着机体的生命活动。在所有生物体内存在类似的包括Clock、Period等节律基因的转录和转录后调控所形成的分子振荡。其中Clock作为近日节律的核心基因，其表达的蛋白Clock与Bmal1形成异二聚体，在近日节律分子振荡中发挥着重要作用。近来研究发现，小鼠生精过程中圆形精子的顶体具有明显的Clock的表达[1]。而在睾丸中，Clock表达的圆形精子期是小鼠生精周期中顶体发育的关键时期[2]，利用RNA干扰(RNAi)技术，干扰Clock小鼠睾丸中的表达，发现雄鼠睾丸Clock蛋白的表达明显下调，顶体酶活性明显下降，生殖功能明显下降[3]，提示节律基因Clock可能与精子的受精能力有关。本文利用RNA干扰(RNAi)技术，干扰Clock在小鼠睾丸中的表达，进一步探讨Clock基因对小鼠生殖功能影响的机制。　　

1 材料与方法　　

1.1 材料　　

1.1.1 动物 SPF级ICR小鼠，雄鼠6～8w，雌鼠4～6w，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。在12L∶12D光暗循环下自由饮食，雌雄分笼饲养，标准小鼠笼具。　　

1.1.2 主要试剂 Clock干扰质粒和阴性对照质粒(由本实验室提供)，小鼠芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA 检测试剂盒(Unionhonest公司生产)，其余试剂均由实验室提供。　　

1.2 方法　　

1.2.1 体内实验(胎仔数) 20只雄鼠随机分为干扰组(RNAi)和对照组(Control)，每组10只。乙醚麻醉，固定双侧睾丸，分别用微量注射器将干扰质粒(干扰组) 和空质粒(对照组)于双侧睾丸各注射20μl。注射后16d的13∶00-14∶00对雌鼠进行腹腔注射PMSG(孕马血清促性脉激素)，46-48h后腹腔注射hCG。雌鼠注射HCG(人绒毛膜促性脉激素)后的当天将两组雄鼠按雌雄2∶1 的比例合笼。雌鼠受孕后立即处死雄鼠，测定精子数量以及精子活力。合笼后受孕的雌鼠大约在21d 开始产仔，分别计数每只雌鼠的胎仔数。　　

1.2.1.1 精子计数 雄鼠处死后，立即剪开附睾尾，放置于盛有1.5 ml T6(人脉巴细胞亚群分样)+ 15 mg·ml-1 BSA(牛血清白蛋白)培养基的表面皿中，37℃ 、5%CO2孵箱预平衡过夜。随后将附睾尾剪成四段，在37℃、5% CO2孵箱中孵育30min，让精子充分游出，立即计数精子数量。　　

1.2.1.2 精子活力 精子从附睾尾释放出来2～4h内，在高倍镜下观察5～10个视野， 计数100个精子并进行分级。精子活力分为4级，快速前向运动为+ + +、慢而呆滞的前向运动为+ + 、非前向运动为+、原地不动为- 。　　

1.2.2 体外受精(IVF) 取20只4～6w雌鼠，以48 h间隔腹腔注射PMSG 10IU 和hCG 10IU诱发超排卵，注射hCG 后15～16h处死小鼠，立即开腹取出输卵管，放进0.5mlT6+ 20 mg·ml-1 BSA培养皿内，在解剖镜下用解剖针撕开膨大的壶腹部，将卵丘细胞包围的合子团释放出来。将合子在透明质酸酶溶液中放置到卵丘细胞脱掉为止。用移卵管将合子收集并转移到含新鲜的M2培养液中，洗几次以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞以及杂质。然后将合子转移到微滴培养皿中，用平衡好的培养液洗涤3次后，转入事先在37℃、5%CO2孵箱预平衡过夜T6+ 20 mg·ml-1 BSA受精滴中，并准确计数加入到每个受精滴中卵细胞数。把4～10μl 孵育过的干扰组和对照组的小鼠精子悬浮液分别加入到含有卵丘卵母细胞复合体的受精滴中， 精子浓度为1×106·ml-1左右。将培养皿中加入精、卵细胞的受精滴放回37℃、5%CO2孵箱保持孵育5～6h。用200倍倒置显微镜观察并计数两组20个受精滴中的二细胞数量，即受精卵的数量，评价精子的体外受精率。　　

1.2.3 Clock干扰质粒对顶体内的酶的影响　　

1.2.3.1 透明质酸酶活性检测[4] 　　

在同时注射干扰质粒和空质粒18d后，分别处死两组小鼠，摘除附睾尾，在PBS中去除附着在附睾上的脂肪，立即放入盛有1ml TYH培养基的表面皿中于37℃ 、5%CO2孵箱中孵育30min，计数精子数量。300×g离心5min，调整精子浓度达到约108·ml-1。取0.2ml精子悬液，加入1ml 0.15mol·L-1的NaCl(1∶5)稀释。取1ml稀释后悬液加入到0.1 ml的醋酸盐缓冲液和0.1ml 的透明质酸底物的混合物中，37℃恒温孵育24h后，100℃加热5min，进一步冰水浴冷却2-4min。再以500×g离心5min后取上清液，加入60μl的四硼酸钾，100℃水浴5min，冰水浴冷却2-4min。加入2ml的DMAB(二甲胺硼烷)混匀后，37℃水浴中孵育20min。将反应混合物以1500×g离心10min，取上清液。在30min之内测582 nm处的吸光度。HAE活性计算方法：一个单位的透明质酸酶的定义是37℃时1h内引起1μmol等量的N-乙酰葡萄糖胺的释放的量。透明质酸酶的活性以x±sd.M.(μmolNAG·h·L-1)表示。　　

1.2.3.2 芳香基硫酸酯酶A含量的测定[5,6]

将精子悬浊液350×g离心10min，弃上清液后加入细胞裂解液，调整精子浓度为20×106·ml-1，混匀后4℃孵育5min，4℃、10000×g离心10min，取上清液，按照芳香基硫酸酯酶A(ASA)ELISA 检测试剂盒中步骤测定样本的ASA含量。　　

1.3 统计学处理　　

观测值以(x±s) 表示。组间均数的比较用t检验，同组内均数间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异显著，有统计学意义。　　

2 结果　　

2.1 Clock干扰质粒对小鼠的胎仔数的影响　　雄鼠注射质粒18d后，干扰组所引起的雌鼠的胎仔数低于对照组(P<0.05)(见表1)，Clock干扰质粒明显影响了小鼠的生育功能。表1 Clock干扰质粒对雄鼠致雌鼠怀孕的胎仔数的影响

2.2 Clock干扰质粒对雄鼠精子数量和活力以及体外受精率的影响　　

干扰组和对照组雄鼠精子数量、精子活力和体外受精率的差异无统计学意义。

2.3 Clock干扰质粒对小鼠精子透明质酸酶和芳香基透明质酸酯酶A的影响　　

干扰组小鼠精子的透明质酸酶的活性与实验组相比较，无显著性改变(表3)两组小鼠精子的芳香基硫酸酯酶的定量结果也无统计学意义。表3 Clock干扰质粒对小鼠精子透明质酸酶和芳香基透明质酸酯酶A的影响

3 讨论　　

目前研究表明，哺乳动物的生物节律及节律基因与生殖功能存在一定的关系。对小鼠睾丸近日节律基因的研究发现，近日节律基因Clock、Per1、Per2、Bmal1和Cry1限制性表达在睾丸精子生成过程中不同的细胞类型， 而Clock、Bmal1并未形成异二聚体聚合在细胞核内参与驱动转录的过程[1]。在小鼠生精周期中，圆形精子期是顶体发育最重要的阶段，Clock限制性地表达于圆形精子期的顶体[1]。而顶体是精卵结合不可或缺的重要结构。精子头部的顶体及其酶主要在睾丸内精子发生的过程中形成[7]，通过成熟精子的顶体反应所释放的透明质酸酶，可消化卵子透明带外面的细胞外基质，并由精子携带的顶体蛋白酶促使精子穿过透明带。只有经过顶体反应的精子才能穿过透明带，并与卵膜融合。同时位于精子顶体上的芳香基硫酸酯酶A在卵子脱颗粒过程中也起到了一定作用[5]。　　

通过RNAi干扰技术，已发现干扰小鼠精子的Clock基因表达后，小鼠的生育能力下降[8]。本实验进一步研究Clock基因影响小鼠生殖功能的机制，发现小鼠精子的透明质酸酯酶的活性和芳香基硫酸酯酶的含量均无明显差异，同时对精子的数量、活力和受精率也均无明显改变，但干扰组所引起的雌鼠的胎仔数明显减少。现有资料显示，小鼠的近日节律基因在植入前的胚胎中也有表达[9]。因此，我们认为干扰雄鼠的Clock基因可能影响了受精卵及胚胎的发育，导致受精卵不着床、胚胎在子宫内发育不全死亡或被吸收，从而导致了小鼠生育功能的下降，具体的影响机制还需要进一步研究和探讨。

【参考文献】 　　

1.A lvarez J, Chen D, Storer E,et al. A Non-cyclic and developmental stage-specific expression of circadian clock proteins during murine spermatogenesis[J]. Biol Reprod, 2003, 69(1): 81-91. 　　

2.Clermont Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: sem iniferous epithelium cycle and spermatogonial renewal[J]. Physiol Rev, 1972, 52(1): 198-236. 　　

3.蒋小辉,叶珊,汪宇辉,等. 节律基因Clock对雄性小鼠顶体酶活性的影响[J]. 航天医学与医学工程, 2007, 19(3): 339-341. 　　

4.Wiklinson CR, Bower LM, Warren C. Measurement of yaluronidase activity in normal human serum[J]. Pharm Biomed Anal, 1996, 14(6): 707-712. 　　

5.Tantibhedhyangkul J, Weerachatyanukul W, Carmona E,et al. Role of sperm surface arylsulfatase a in mouse sperm-zona pellucida binding[J]. Biol Reprod, 2002, 67(1): 212-219. 　　

6. Wu A, Anupriwan A, Iamsaard S,et al. Sperm surface arylsulfatase A can disperse the cumulus matrix of cumulus oocyte complexes[J]. J Cell Physiol, 2007, 213(1): 201-211. 　　

7. Abou-Haila A, Tulsiani DR. Mammalian sperm acrosome: formation, contents, and function[J]. Arch Biochem Biophys, 2000, 379(2): 173-182. 　　

8.蒋小辉,叶珊,汪宇辉,等. 近日节律基因Clock对雄性小鼠生殖功能的影响[J]. 航天医学与医学工程, 2007, 20(5): 354-357. 　　

9.Kennaway DJ, Varcoe TJ, Mau VJ. Rhythmic expression of clock and clock-controlled genes in the rat oviduct[J]. Mol Hum Reprod, 2003, 9(9): 503-507.