产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的筛查

　　随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌逐年增多，此类细菌耐受包括碳青霉烯类抗菌药物在内的所有β。内酰胺类抗菌药物。获得性碳青霉烯酶的发现，使得碳青霉烯类抗菌药物在肠杆菌科细菌中的地位受到了威胁。为深入了解临床肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的情况，对中山大学附属第一医院2008年5月至2010年4月分离的厄他培南耐药的肠杆菌科细菌进行筛查。　　1 资料与方法　　1.1一般资料收集中山大学附属第一医院2008年5月至2010年4月临床分离的27株[厄他培南最低抑菌浓度（MIC）≥2μg/mL]肠杆菌科菌株，不包括同一患者同一部位同一时期分离的重复菌株。细菌经法国生物梅里埃公司的Vitek2细菌鉴定系统鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922.　　1.2仪器与试剂　　1.2.1主要仪器法国生物梅里埃公司提供的Vitek2细菌鉴定系统，美国Corning公司提供的96孔板，上海跃进医疗器械厂提供的电热恒温培养箱。　　1.2.2抗菌药物杭州默沙东制药有限公司提供的厄他培南、亚胺培南西司他丁钠；住友制药苏州有限公司提供的美罗培南；英国Oxoid公司提供的厄他培南纸片（10μg/mL）。　　1.2.3溶剂0.01mmol/LPBS缓冲液，以及安徽双鹤药业有限责任公司提供的灭菌注射用水。　　1.2.4培养基法国生物梅里埃公司提供的MH培养基，广东环凯微生物科技有限公司提供的LB肉汤培养基。　　1.3方法　　1.3.1药敏试验微量肉汤稀释法测定厄他培南、亚胺培南和美罗培南的MIC值，根据CLSIM100.S22文件判断药敏试验结果。　　1.3.2表型确证试验用改良Hodge试验检测碳青霉烯酶，操作方法及结果判断标准参照CLSIM100.S22文件。阳性对照：经基因确定产KPC.2的肺炎克雷伯菌；阴性对照：大肠埃希菌ATCC25922.　　2 结果　　2.1药敏试验结果27株菌株中，包括15株阴沟肠杆菌、7株大肠埃希菌、2株肺炎克雷伯菌、2株弗氏柠檬酸杆菌和1株产酸克雷伯菌。27株菌株均对厄他培南耐药。15株阴沟肠杆菌中对亚胺培南耐药的占20%（3/15），对美罗培南耐药的占46.7%（7/15）。7株大肠埃希菌中对亚胺培南耐药的占42.9%（3/7），对美罗培南耐药的占71.4%（5/7）。2株肺炎克雷伯菌和2株弗氏柠檬酸杆菌对亚胺培南、美罗培南均敏感。1株产酸克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南均耐药，见表1.　　2.2Hodge试验结果27株菌株中，3株阳性（包括2株阴沟肠杆菌，1株产酸克雷伯菌），阳性率为11.1%;24株阴性。Hodge试验阳性菌株对美罗培南全部耐药，对亚胺培南2株耐药，1株中介。Hodge试验结果判断如图1、2所示。　　3 讨论　　碳青霉烯类抗菌药物是一类抗菌谱广、抗菌活性强、毒性低、耐酶且稳定的抗菌药物。目前肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制主要有3种。（1）产碳青霉烯酶是最主要的耐药机制，按Ambler分子分类为A、B、D3类酶；（2）外膜蛋白的缺失或表达减少；（3）药物作用靶位的改变[1].B类酶为金属酶，属于Bush分群中的第3组，见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌；A类、D类酶为丝氨酸酶，属于Bush分群中的第2f和2d亚组。A类酶见于一些肠杆菌科细菌，D类酶仅见于不动杆菌。在肠杆菌科细菌中我国已报道的碳青霉烯酶主要以肺炎克雷伯菌中的KPC.2为主，国外以KPC.2、KPC.3为主[2].据CLSIM100文件推荐，改良Hodge试验用于肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的筛查有较高的敏感性（>90%）和特异性（>90%）。叶智颖等[3]报道，用改良Hodge试验筛查肺炎克雷伯菌的KPC酶，阳性率为72.2%.安军等[4]报道用改良Hodge试验筛查肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶的阳性率为92.8%,大肠埃希菌的阳性率为37.5%.说明此方法用于产碳青霉烯酶　　肠杆菌科细菌的筛查，结果敏感性高，操作简单，适合临床实验室推广应用。本组数据的阳性率远低于国内相关报道，说明碳青霉烯酶的产生有地域差异性，这种差异可能与各地抗菌药物的使用差异及耐药菌株的克隆差异有关。本次研究中厄他培南的MIC值在2~8μg/mL之间的菌株改良Hodge试验均为阴性，3株阳性菌株厄他培南的MIC≥32μg/mL,说明产碳青霉烯酶菌株对厄他培南、美罗培南为高度耐药，对亚胺培南可为中介或耐药。细菌产生β。内酰胺酶多与抗菌药物选择压力有关，如超广谱β。内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）与第三代头孢菌素的过度使用有关，碳青霉烯酶与碳青霉烯类抗菌药物使用有关。3例Hodge试验阳性菌株患者病历资料显示，患者在阳性菌株标本采集前均未使用过碳青霉烯类抗菌药物，有长期使用广谱β。内酰胺类抗菌药物或β。内酰胺类/酶抑制剂的情况提示肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶并不一定是碳青霉烯类抗菌药物选择压力所致，长期使用广谱头孢菌素或β。内酰胺类/酶抑制剂等广谱抗菌药物可能是诱导产碳青霉烯酶的因素之一。国外研究亦提示[5.6],碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌源于广谱抗菌药物的选择压力，包括广谱头孢菌素、β。内酰胺类/酶抑制剂、碳青霉烯类等，但未特指哪一类的抗菌药物。病例资料显示，3例患者有2例死亡，1例好转出院，患者预后不良。由于产碳青霉烯酶菌株对各种抗菌药物的高度耐药，此类感染临床常规用药难于有效控制感染，根据药敏试验结果及时调整用药方案，是抗感染治疗成功的关键。23株改良Hodge试验阴性的菌株中，对厄他培南耐药的原因并非产碳青霉烯酶，根据相关文献[7]报道，其耐药机制可能是与产ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失有关。综上所述，改良Hodge试验用于肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的筛查简单、易行，可在临床实验室中常规开展。产碳青霉烯酶菌株对常用抗菌药物高度耐药，患者预后不良。广谱抗菌药物的大量使用是诱导细菌产碳青霉烯酶的原因之一，合理用药有利于减少耐药菌株的产生。　　参考文献　　[1]刘雅，康梅。临床分离的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的研究进展[J].华西医学，2013,28（4）：631.635.　　[2]纪明宇，耿大影，裴凤艳，等。KPC型碳青霉烯酶研究概况及进展[J].临床检验杂志，2013,31（4）：282.285.　　[3]叶智颖，吕火祥，胡庆丰，等。耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌KPC酶检测分析[J].中国卫生检验杂志，2011,21（2）：454.455,457.　　[4]安军，蔡挺，张顺，等。大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶的表型检测及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2011,21（21）：4423.4425.　　[5]GuptaN,LimbagoBM,PatelJB,etal.Carbapenem.resistantEn.terobacteriaceae:epidemiologyandprevention[J].ClinInfectDis,2011,53（1）：60.67.　　[6]KritsotakisEI,TsioutisC,RoumbelakiM,etal.Antibioticuseantheriskofcarbapenem.resistantextended.spectrum.{beta}.lacta.mase.producingKlebsiellapneumoniaeinfectioninhospitalizepatients:resultsofadoublecase.controlstudy[J].JAntimicrobChemother,2011,66（6）：1383.1391.　　[7]AndersonKF,LonswayDR,RasheedJK,etal.EvaluationofmethodstoidentifytheKlebsiellapneumoniaecarbapenemaseinEnterobacteriaceae[J].JClinMicrobiol,2007,45（8）：2723.2725.　　（收稿日期：2013.11.22）