壳聚糖/液晶复合水凝胶的制备及细胞相容性研究

随着生物材料及组织工程领域取得的进展,已发展出多种构建仿生材料的表面工程技术[1-2]。表面工程化的生物材料已被证明对蛋白吸附、细胞相互作用及宿主反应有重要作用[3-4]。其中仿生化表面是生物材料制备的重要策略,如表面引入生物活性分子(细胞结合位点、生长因子等)[2],或构建软物质细胞模型均是促进细胞附着、增殖、分化及细胞相互作用的有效手段[1]。由于合成材料缺少细胞识别位点,因此天然材料成为用于组织修复及构建三维细胞培养模型仿生设计的理想选择。

壳聚糖(chitosan,CS)是继纤维素后自然界中存在最多的天然多糖,由于其物化性质、生物性能及理想的生物活性[5]而被认为具有极高的生物医用价值。壳聚糖基水凝胶因具有与软组织相近的机械性能,其较低的界面张力使细胞易于跨越组织/植人体界面,同时其亲水性的三维网状结构有利于营养物质、氧气及代谢产物的运输[6]而广泛应用于药物控制释放及细胞培养。但是,纯粹的天然材料仍存有缺陷,无法满足理想仿生设计的苛刻要求。

本研究将选择具有一定流动及取向性的羟丙基纤维素酯类液晶与壳聚糖水凝胶复合,构建仿生壳聚糖/液晶(CS/LC)复合水凝胶作为细胞培养基体以调控细胞与生物材料界面的相互作用。本课题组前期研究结果已显示,羟丙基纤维素酯与聚合物材料复合后,可在聚合物基体中自发形成液晶畴,而后与基质材料构成相分离,此结构形态类似于生物膜的液晶态结构因而呈现出良好的细胞相容性[7]。本文拟构建壳聚糖/羟丙基纤维素酯液晶复合水凝胶,通过探索复合水凝胶的表面形貌及液晶与壳聚糖的相分离结构,探究此仿生结构及液晶相对细胞相容性的影响,研究结果将为此类新型仿生液晶态材料应用于生物医用领域提供科学依据。

材料和方法

1  材料CS(分子量350OO0)购自Sigma,使用前纯化;所用其它试剂均为分析纯。2种羟丙基纤维素酯由本实验室合成,即羟丙基纤维素辛酯和羟丙基纤维素丁酯[8]。液晶的化学合成过程如图1所示。

壳聚糖脱乙酰度采用线性电位滴定法测量,结果测得脱乙酰度为67.36%。

2  物理交联CS/LC复合水凝胶的制备

称取适量CS粉末分散于与其氨基等当量的盐酸中进行氨基质子化作用,经1d充分溶解后加人与盐酸等质量的1,2-丙二醇,充分混合1d获得混合溶液,此时壳聚糖浓度为1%(m/m)。称取一定质量的BPC/0PC溶于乙醇,CS:LC(m/m)分别为1:1、1:2和1:3(标记为LC-1、LC-2和LC-3),用喷雾法将LC混合液加人CS溶液中并快速搅拌,将制得的混合溶液倒入模具中,在50℃环境下去除水和有机溶剂,得到壳聚糖/液晶复合醇凝胶。将所制凝胶在1mol/LNa0H溶液中浸泡1d,大量去离子水充分清洗。

3  CS/LC复合水凝胶的表征

3.1  Ⅹ射线衍射(XRD)分析  取一定质量壳聚糖/液晶复合水凝胶,液氮冷冻后通过冷冻干燥机干燥,样品压片后用D/MAX-1200型Ⅹ射线衍射仪(Rigaku)进行测试,以Cu射线为射线源,扫描速度8°/min,步宽0.02°,扫描角度(2θ)为5~60°,分析样品的结晶行为。

3.2  扫描电镜(SEM)观察  将不同液晶含量的壳聚糖/液晶复合水凝胶膜用液氮冷冻后通过冷冻干燥机干燥,样品喷金处理后用ⅩL-30ESEM型扫描电子显微镜(Philips)观察其表面微观形貌特征。

4  细胞相容性研究

4.1  成纤维细胞活性测定细胞活性测定  选用改良的MTT法。

BPC/0PC制备成厚度约1mm膜,壳聚糖水凝胶以及各比例的壳聚糖/液晶复合水凝胶制成膜,经过[60Co]灭菌后铺于娲孔板底部,每组3个平行样本,无菌PBS冲洗后种板。取冻存的3T3小鼠胚胎成纤维细胞进行复苏,传至第3代后进人对数生长期。0.25%胰酶消化收集细胞,离心并加入培养基吹打获得均匀的单细胞悬液,倒置显微镜下通过血球计数板计数并调节细胞悬液至1.5×107/L,以每孔5OOuL接种于材料上,每隔2d换1次培养基。

细胞培养1d、3d、5d和7d后每孔加人100uLMTT并继续在C02细胞培养箱中培养 4h,再加入5OOuL三联液并继续在C02细胞培养箱中培养,1d后依次将混合液移人96孔板中,在检测波长570nm、参考波长630nm处测量吸光度,所有操作需避光进行。

4.2  细胞形态观察  BPC/0PC膜,CS水凝胶以及各比例的壳聚糖/液晶复合水凝胶膜的制备及材料表面3T3小鼠胚胎成纤维细胞的培养同上。细胞培养3d和6d后,PBS冲洗3次,2.5%戊二醛固定1h,75%、85%、95%和100%梯度乙醇脱水后冻干进行喷金处理,用XL-30ESEM型扫描电子显微镜观察细胞生长状态。

5  统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(0ne-way AN0VA)和LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 CS/LC复合水凝胶微观结构观察

图2为不同比例的CS/LC(BPC或0PC)复合水凝胶的SEM照片,结果显示,LC均匀地分布在CS基质中聚集成液晶畴,与CS形成“海-岛”状相分离结构,类似生物膜的“流动镶嵌模型”。随着液晶含量增多,液晶畴密度增大。当CS:LC质量比达到1:1时,液晶畴向外伸展,开始相互连接,但其尺寸保持在4~10um。

液晶态已被证明广泛存在于生物体系中并通过非共价键相互作用进行自发的有序排列[9]。本研究制备的CS/LC复合水凝胶中镶嵌的微米尺寸液晶畴,其呈现的有序结构可视为活性位点,可作为组织工程活细胞界面。

2 CS/LC复合水凝胶XRD分析

CS/LC复合水凝胶的XRD谱图如图3所示。结果显示BPC在2θ=7°和20°有2个明显的衍射峰,而CS/BPC复合水凝胶的ⅩRD谱图与纯CS水凝胶类似,无明显的衍射峰。当在CS基质中引人BPC后,由于受到CS水凝胶三维网状结构的束缚,BPC无法自聚集形成较大的本体结构而形成小而分散的BPC畴,因此在XRD谱图中未见明显的衍射峰,表明CS/BPC复合水凝胶主要呈现非晶态。同样,CS/0PC复合水凝胶的XRD谱图也呈现类似的结果。

3  CS/LC复合水凝胶的细胞相容性

3.1  细胞活性测定  图4显示3T3成纤维细胞在CS水凝胶、CS/LC复合水凝胶及纯LC膜表面培养不同周期(1、3、5、7d)的细胞活性,组织培养板(TCPS)作为空白对照组。结果显示,3T3细胞在CS/LC复合水凝胶及TCPs表面增殖情况相近,但优于纯LC膜表面。体外培养1d后,复合水凝胶表面的细胞增殖速率明显高于TC"及纯LC膜表面,这归因于复合水凝胶具有的类软组织黏弹性及液晶畴流动特性促进了细胞的早期黏附。培养3d后,Cs水凝胶及CS/LC复合水凝胶表面的细胞增殖率显著增加,表明水凝胶体系对细胞增殖有很好的促进作用。CS/0PC复合水凝胶表面细胞的增殖速率明显优于CS/BPC表面,这是由于OPC大分子本身结构中含有长而柔的侧链,使CS/OPC复合水凝胶的黏弹性更接近于软组织[10],这种可调的液晶刚-柔界面[11]可大大促进细胞的增殖。

3.2  细胞形态观察  图5显示3T3成纤维细胞在CS水凝胶及不同比例CS/LC复合水凝胶表面培养3d的细胞形态。SEM观察显示细胞呈球形,且分泌出大量细胞外基质(ECM),细胞通过ECM相互连接,表明细胞在材料表面呈现良好的生长状态。图6显示了细胞在材料表面培养6d的细胞形态。细胞在纯LC膜表面只是均匀地伸展,而在复合水凝胶上则彼此连接并覆盖整个表面区域,表明细胞在复合水凝胶基质上大量繁殖。与纯CS水凝胶相比较,细胞在CS/LC表面分泌出更多的ECM,由此揭示复合水凝胶体系结构中的CS与LC之间产生协同作用,从而促进了细胞的铺展和增殖。

讨论

CS具有与人体黏多糖分子相近的化学结构,而CS水凝胶具有类似于人体软组织的黏弹性从而能促进细胞的黏附和生长。在CS基体中引入胆甾型液晶(BPC/0PC)可构成具有相分离结构的CS/LC复合水凝胶,其“海-岛”状表面形态类似于生物膜的“流体镶嵌模型”,这种有序结构可促进细胞的早期黏附,并通过提供大量的活性位点促进细胞的增殖、迁移及ECM的分泌[12]。由于CS/LC复合水凝胶结合了水凝胶类软组织黏弹性及液晶有序性和流动性的特征,因而增进了细胞与基质界面之间的相互作用。同时疏水性LC与亲水性Cs之间通过相分离构成的亲-疏水平衡达到恰好适于细胞黏附和生长的程度[13]。基质的黏弹性对细胞的相互接触与黏附有重要影响,本研究中制备的CS/LC复合水凝胶所具有的类软组织黏弹性为细胞的生长提供了良好的环境。近年来,液晶在生物体系中的应用得到越来越多的关注,其分子通过非共价键相互作用自发形成的有序排列和周期性结构为生物科学的研究提供了理论基础,亦为组织工程材料设计提供重要的策略。本研究选用具有有序结构的液晶BPC/0PC构建CS/LC复合水凝胶体系,其中均匀分布于CS基体中的液晶畴形成流动性的表面,类似于生物膜的特J眭,从而促进了细胞与材料表面的相互作用。因此,同时具备类软组织黏弹性及液晶有序性和流动性特征的CS/LC复合水凝胶,有望成为活性生物材料在组织工程中作为活细胞界面。

本研究构建的具有仿生结构的CS/LC复合水凝胶,当LC复合到CS基体中,LC自发形成液晶畴并均匀分布于具有三维网状结构的水凝胶中,复合水凝胶体系主要呈现非晶态。LC含量较低时,LC在CS基质中形成物理交联点;随着LC含量的增多,液晶畴逐渐增大且在CS基质中形成岛状分布,与CS共同构成类生物膜的“流体镶嵌模型”。当CS与LC比例达到⒈1时,LC畴向外伸展彼此相连,但LC畴尺寸仍保持在4~10um范围内。细胞相容性研究表明,3T3细胞在CVLC复合基质表面呈现良好的黏附和增殖。培养3d和6d后,细胞完全覆盖复合水凝胶表面并分泌大量的ECM,说明Cs/LC复合水凝胶体系中CS与LC产生协同效应从而大大促进细胞的生长。

本研究制各的CS/LC复合水凝胶集类软组织黏弹性及液晶有序性和流动性的特征于一体,有效增进细胞与复合水凝胶界面间的相互作用。此类CS/LC复合水凝胶仿生材料有望作为活性生物材料在组织工程中得到广泛应用。