小鼠同种异基因骨髓移植aGVHD动物模型的建立

作者                     作者单位

蔡芳芳   温州医学院附属第一医院 血液科，浙江 温州 32500

俞康     温州医学院附属第一医院 血液科，浙江 温州 32500

江松福   温州医学院附属第一医院 血液科，浙江 温州 325000

Establishment of a mouse model of acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation CAI Fang-fang，YU Kang，JIANG Song-fu. Department of Hematology，the First Af-filiated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Abstract: Objective: To establish a mouse model of acute graft-versus-host disease (aGVHD) after allogeneic bone marrow transplantation (Allo-BMT) for providing experimental studies of aGVHD. Methods：Male C57BL/6(H-2b)mice were used as donors and female BALB/C(H-2d)mice as recipients.All BALB/C(H-2d) mice were randomly divided into 7 groups and received total body irradiation (TBI) 8.0Gy at 4～6 hours prior to transplantation.Bone marrow cells mixed with spleen cells of donors based upon different proportions were injected into the tail vein.Their survival time，leucocyte counts of peripheral blood，clinical and pathologic manifestations of aGVHD were evaluated.Results：Several mice in the group infused with only bone marrow cells showed insignificant aGVHD evidence，75% mice survived for a long period (>30 d). There were significant differences in the incidence and severity of aGVHD with different ratios of bone marrow cells and spleen cells. The groups with co-transplantation of bone marrow cells and spleen cells in ratio of 1.5:1 or 1:1 showed typical clinical and pathological manifestations of aGVHD at a relatively concentrated time(8～15 d).Conclusion ：To establish a mice model of aGVHD needs additional donor’s spleen cells. Infusion of bone marrow cells and spleen cells in ratio of 1.5:1 or 1:1 is perfect as to establish aGVHD mouse model after allogeneic bone marrow transplantation.

Key words: mice;allogeneic bone marrow transplantation;acute graft-versus-host disease; animal model

迄今为止，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)仍是影响异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation， Allo-BMT)预后的主要因素之一。本研究用近交系C57BL/6和BALB/C小鼠进行同/异基因移植，观察单纯输注骨髓细胞能否引起明显的急性移植物抗宿主病(acute graftversus-host disease， aGVHD)，骨髓细胞和脾细胞联合输注是否为建立模型所必需，同时探讨不同比例的骨髓细胞与脾细胞对诱发aGVHD的影响，以建立一个稳定的Allo-BMT aGVHD动物模型，为aGVHD的研究提供技术平台。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性C57BL/6(H-2b)为供鼠，雌性BALB/C(H-2d)为受鼠或供鼠(同基因移植组)，均为6～8周龄，体重为18～22 g。实验动物均购于上海中科院，许可证号：SCXK(沪)2003-0003。

1.1.2 主要试剂及仪器：RPMI 1640培养基(Gibco公司，美国)，直线加速器(VARIAN CL2300C/D，美国)。

1.2 方法

1.2.1 受鼠的术前准备及饲养条件：受鼠饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。饲料及饮水经灭菌处理，移植受鼠前5 d开始饮用含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的无菌水，并持续至移植后3周，进行肠道净化。

1.2.2 供鼠骨髓细胞及脾细胞制备：采用颈椎脱位法将供鼠处死，75%乙醇浸泡消毒5 min后，在超净台内无菌切取股骨、胫骨及脾脏，剪开股骨、胫骨两端骨骺，用注射器吸取RPMI 1640液反复冲洗髓腔，200目金属网过滤制备单细胞悬液，离心后去上清，裂解红细胞后用不含血清的RPMI 1640培养液洗涤2次，细胞计数并调成所需细胞浓度备用(1×108/mL)，台盼蓝染色活细胞数>95%。脾脏剪成小块后在200目金属网上用注射器针芯轻轻研磨，同时用RPMI 1640液冲洗过滤成单细胞悬液，离心后去上清液，裂解红细胞，用不含血清的RPMI 1640培养液洗涤2次，细胞计数并调成所需细胞浓度备用(1×108/mL)，台盼蓝染色活细胞数>95%。

1.2.3 受鼠的分组及移植过程：实验动物按移植物不同随机分为7组，每组8只(见表1)。移植当日将受鼠装入自制无菌包装的有孔塑料盒内，接受直线加速器全身照射(total body irradiation， TBI)，剂量：8.0 Gy，照射距离：50 cm，照射时间：8 min，剂量率：1.0 Gy/min。TBI后4～6 h内经尾静脉注入移植物(骨髓细胞按受鼠体重2×108/kg的标准输注)。移植物根据分组按不同的细胞数混合，每只受鼠输入细胞体积≤0.5 mL。

1.3 移植物抗宿主病的监测指标及判定标准

1.3.1 观察指标。观察小鼠的生存期，计算生存率;观察各移植组有无腹泻、体重下降、弓背、活动度下降及皮肤脱毛溃疡等临床表现，并予以临床aGVHD评分[1]。定期球后静脉取血计数各组外周血白细胞;病理检查：取濒死小鼠的皮肤、小肠及肝组织作病理切片HE染色，光镜下观察。按Thomas GVHD病理组织学分级标准[2]判定。

1.3.2 判断标准。移植失败：照射后很快死亡，死亡时外周血白细胞计数<0.5×109/L。aGVHD发生：外周血白细胞计数>0.5×109/L;并有倦怠、精神萎靡、嗜睡、纳差、体重减轻、弓背、脱毛及竖毛、腹泻等症状;病理检查可见肝、肠、皮肤等组织淋巴细胞浸润，正常组织结构破坏，伴有局灶性出血等改变。移植后感染：外周血白细胞>0.5×109/L，外周血见中性粒细胞核左移，胞浆中有中毒颗粒。造血衰竭：死亡时外周血白细胞<0.5×109/L。造血重建：状态好，体重增加，外周血白细胞>0.5×109/L。长期生存：造血免疫重建，生存期>30 d，体重、饮食、活动均正常。

1.4 统计学处理方法 多组计量数据比较先进行正态性及多个方差齐性检验，满足条件的采用方差分析，如有差别用LSD-t法再行两两比较。检验水准a=0.05(双侧)，用Kaplan-Meier法绘制各组大鼠生存曲线。

2 结果

2.1 观察比较各组小鼠的一般情况及生存期 A组小鼠于照射后体重进行性下降，伴活动减少，皱毛、弓背，但无腹泻。照射后第6天开始有小鼠死亡，第11天全部死亡，中位生存时间为8.5 d，与各移植组相比差异有显著性(P<0.05)。死亡原因均为造血衰竭，死亡时外周血白细胞均<0.5×109/L，病死率达100%。B组小鼠存活时间均>30 d，为长期存活。第1周内体重变化趋势与A组相类似，第7天起体重逐渐增加，至第3周体重恢复正常并继续增加。移植后第20天左右外周血白细胞恢复至正常水平。C组小鼠开始症状同A组，第11天左右小鼠精神、活动逐渐恢复。在移植后第2周，出现体重下降、弓背体位、活动度差，竖毛等轻微的aGVHD表现。6只(占75%)小鼠生存时间>30 d。D～G组为异基因骨髓细胞和脾细胞混合移植组，均于30 d观察期内死亡，中位生存期分别为30 d、19.5 d、17 d及8 d。D～F死亡前均有不同程度的腹泻、体重下降、弓背、翘毛、活动度下降、皮肤脱毛等aGVHD的临床表现。其中D组小鼠生存时间差异较大，存活期为移植后9～60 d，出现aGVHD的时间也较不一致，与E、F两组相比差异有显著性(P<0.05)。G组小鼠在移植后10 d内全部死亡，临床未观察到典型的aGVHD表现。生存曲线见图1，移植后小鼠体重变化见图2。

2.2 各组外周血白细胞计数的监测 A组小鼠第6天外周血白细胞数为(0.20±0.03)×109/L，与移植组(B、C、D、E、F组)小鼠白细胞[(1.05±0.34)×109/L、(1.45±0.52)×109/L、(1.35±0.57)×109/L、(1.35±0.57)×109/L、(1.35±0.57)×109/L)]比较差异有显著性(P<0.05)，而B、C、D、E、F组第6天白细胞数差异无显著性(P>0.05)，此后A组小鼠白细胞数持续下降，于11 d内全部死于造血衰竭。B、C、D、E、F组照射后1周内，外周血白细胞较移植前明显下降，移植后第15天，外周血白细胞亦差异无显著性(P>0.05)。C、E组3周后显著回升，B、C、D、E、F组20 d后恢复正常。G组小鼠均于移植后10 d内死亡，死亡时，白细胞数均<0.5×109/L。移植后各组小鼠外周血白细胞计数如图3。

2.3 组织病理学观察 A、B、C组小鼠肝、小肠、和皮肤病理检查未见明显异常。D～F组小鼠的肝脏及小肠均示有不同程度的病理改变。D组aGVHD的肝脏病理表现为肝实质见散在点状坏死，汇管区及毛细胆管周围少量淋巴细胞浸润;肠病理表现为肠黏膜上皮细胞轻中度坏死脱落，黏膜下有少量淋巴细胞浸润，病理改变属于GVHD II级。而E、F组的肝脏病理主要表现为肝细胞浊肿、嗜酸性变或灶性坏死，汇管区及肝窦扩张、淤血，汇管区炎症反应并有大量淋巴细胞浸润;小肠表现为黏膜上皮坏死脱落，黏膜下层充血水肿，黏膜下层与固有层有较多淋巴细胞浸润，隐窝细胞有变性坏死，腺体有淋巴细胞侵润;皮肤可见散在的炎性细胞;肺泡壁可见充血、渗出、淋巴细胞侵润。病理改变属于GVHD II～III级。G组病理观察未见典型的aGVHD表现。aGVHD小鼠肝脏、肠道、皮肤、肺病理组织学结果见图4。

3 讨论

aGVHD是异基因骨髓移植术后严重的并发症之一，直接影响移植的预后。本研究选择C57BL/6和BALB/C分别作为供受者，两者的H-2抗原完全不同，为MHC不相合移植，与人类同种移植特点接近。为排除组织相容性抗原以外的干扰因素，本研究设立了同基因移植组。

相对温和的预处理可使受体对供体的细胞产生免疫耐受，从而使供者细胞顺利植入受体内。根据本研究预实验的结果，采用8 Gy的致死剂量全身TBI作为预处理。单纯照射可以引起受鼠体重、食欲下降、活动度减少、翘毛，这些放射损伤的表现与aGVHD的初期表现相类似。单纯照射组于11 d内全部死亡，均死于造血衰竭。因此，本研究采用设立单纯照射组来排除放射损伤所引起的效应。通过本研究证实了采用直线加速器的TBI预处理简便可行，可以为移植清空骨髓龛，抑制受者免疫，利于供者细胞的植入。

小鼠接受骨髓移植后是否能长期存活，与输入骨髓单个核细胞的数量密切相关。为确保小鼠移植后能够顺利长期重建造血，结合文献[3-4]，本研究尾静脉回输骨髓单个核细胞的数量为2×107个。BALB/C小鼠接受同基因骨髓细胞和脾细胞移植后，全部存活，且白细胞数均在3周内恢复，证明移植细胞数量足以保证受照射小鼠恢复骨髓重建。

本研究发现单纯输注骨髓细胞并没有发生明显的aGVHD，仅有少部分小鼠有很轻微的aGVHD表现并可自行恢复且长期生存。有研究表明，供鼠T细胞是促进GVHD的发生和嵌合体的形成的主要细胞[5-7]。小鼠骨髓中淋巴细胞含量仅2%，脾脏中淋巴细胞含量高[8]，且骨髓细胞是冲洗获得，混入的外周血少，成熟的T淋巴细胞含量也少。本研究采用同时给予1×107～2×107个的脾细胞，异基因移植各组都发生aGVHD，因此，输入1×107～2×107个脾细胞有利于aGVHD的模型建立。由于未对脾细胞进行T细胞纯化，因此与其他文献[9]报道相比输入脾细胞的数量相对较高。

本研究根据aGVHD临床表现及相应靶器官的病理来评价aGVHD的发生及其严重程度。实验观察到，在单纯骨髓细胞移植组小鼠出现aGVHD表现的时间较晚，程度较轻，且3/4小鼠长期存活，无明显的aGVHD表现。在骨髓与脾细胞2:1移植组，小鼠虽全部出现aGVHD，但aGVHD的程度较轻且临床表现出现的时间有较大的跨度，不利于实验观察。骨髓与脾细胞1:2移植组，小鼠在移植早期10 d内全部死亡，是由于aGVHD还是放射毒性所致不易区分。因此，这两组都不适宜作为研究aGVHD的动物模型。而在骨髓移植与脾细胞1.5:1和1:1输入组，两组小鼠的发病时间相对集中，且出现较为典型的aGVHD临床及较为一致的病理表现，死亡时间也集中于移植后6～24 d内，有利于观察及病理取样，也便于进一步研究干预，可以作为Allo-BMT后aGVHD研究的理想模型。同时本研究发现，在小鼠异基因移植组中，供者T细胞输注量与aGVHD的严重程度有明确的量效关系。单纯骨髓细胞移植组相当于去除T细胞的异基因移植，能够有效地减少aGVHD发生率，并减轻其严重程度。

本研究通过C57BL/6和BALB/C的同种Allo-BMT成功建立了小鼠aGVHD模型，重复性好，aGVHD表现典型，且实验方法简便易行，是一种研究aGVHD发生、发展的可靠的实验动物模型。与同系移植或亲代至子代间骨髓移植建立的aGVHD模型相比较，其特点与人类同种骨髓移植aGVHD发生特点接近，而且由于两种品系均是目前国内最常见的小鼠品系，从而为相关研究提供了有利条件。

致谢：感谢温州医学院附属第一医院放疗科吴式教授、余建义和王纯销技师、内科实验室吴建波波副主任和章圣辉主管技师、病理科杨开颜教授和温州医学院实验动物中心王一龙老师等在本研究中给予的无私帮助。

【参考文献】

[1]Cooke KR, Kobzik L, Martin TR, et al.An experimentalmodel of idiopathic pneumonia syndrome after bone mar-row transplantation:The roles of minor H antigens andendotoxin[J]. Blood,1996,88(8):3230-3239.

[2]何长民,石炳毅.器官移植免疫学[M]. 北京:人民军医出版社,1995:351-368.

[3]Lemoli RM, Bertolini F, Petrucci MT, et al.Functional andkinetic characterization of granulocyte colony-stimulatingfactor-primed CD34+human stem cells[J]. Br J Haematol,2003,123(4):720-729.

[4]Bolanos-Meade J, Vogelsang GB.Novel strategies for ste-roid-refractory acute graft-versus-host disease[J]. Curr OpinHematol,2005,12(1):40-44.

[5]He XD, Weng X, Deng XH, et al.Experimental research oneffects of different T cell ratios of graft to receptor onseverity of GVHD after allo-stem cell transplantation[J]. AiZheng, 2005,24(1):58-61.

[6]吴迪,张梅,贺鹏程.小鼠混合骨髓移植中脾细胞诱导持久稳定嵌合体的作用[J]. 西安交通大学学报, 2007,28(1):31-33.

[7]许红波,李富春.异种骨髓移植移植物抗宿主反应的实验动物模型[J].中国实验血液学杂志,2003,11(1):188-190.

[8]Hashimoto N, Narumi S, Itabashi Y, et al.Efficacy of donorsplenocytes mixed with bone marrow cells for induction oftolerance in sublethally irradiated mice[J].Transpl Immunol,2002,10(1):37-41.

[9]Contassot E,Murphy W,Angonin R, et al.In vivo alloreactivepotential of ex vivo-expanded primary T lymphocytes[J].Transplantation,1998,65(10):1365-1370.