突变生物合成在微生物药物领域的研究进展

作者                  作者单位

白宝星    中国医药集团四川抗菌素工业研究所， 成都600051        

张春燕    中国医药集团四川抗菌素工业研究所， 成都600051

田敏      中国医药集团四川抗菌素工业研究所， 成都600051

朱辉　　  中国医药集团四川抗菌素工业研究所， 成都600051

ABSTRACT Mutational biosynthesis since its rising in1970′s，as a tool for the formation of antibiotic structural analogues，has played an important role and developed some novel derivatives which are still widely used in the clinic today.With the advance of gene engineering，mutants can be obtained by direct gene modifi-cation to certain enzyme in secondary metabolism pathway and efficiency is greatly promoted.In this paper，the progress，especially combining gene engineering of mutational biosynthesis is reviewed.

KEY WORDS Mutational biosynthesis(MBS); Mutasynthon; Blocked mutant; Antibiotics

新疾病的产生和耐药菌的出现，迫切呼唤新的生物活性物质的开发。人们主要从三个途径获得新的活性物质:①自然界;②化学合成以及化学改造;③对产生菌的次级代谢途径进行改造，使其合成途径发生改变，以获得新化合物，主要包括突变生物合成(muta-tional biosynthesis，MBS)和前体定向生物合成(pre-cursor directed biosynthesis，PDB)。尽管前两种方式在新药开发过程中仍然占主导地位，但后者特别是MBS也为一种十分有效的途径，且显示出巨大的潜力。

MBS是指抗生素产生菌经过物理、化学等诱变因素的作用或通过基因改造，生物合成途径中的某一位点发生突变，丧失合成完整抗生素分子的能力而成为阻断突变株。在发酵培养这种阻断突变株时，添加某种天然的或化学合成的化合物——突变合成元(muta- synthon)参与生物合成并获得新抗生素的方法和过程。广义的MBS还包括利用生物合成途径改变获得原抗生素的代谢产物和利用阻断突变株积累一些原始菌株所不能积累的抗生素中间体。

1969年，Shier用MBS方法对新霉素进行结构改造。1975年，Nagaoka等用“idiotroph”——独需型(特需型)来描绘那些需要加入外源前体完成新衍生物合成的突变株，并用“mutational biosynthesis”——突变生物合成来描绘这种技术。1977年Rinehart将这种技术定义为“mutasysthesis”。按照Rinehart的解释，利用MBS技术制备新衍生物应包括:①突变株的获得;②突变合成元的获得;③添加的突变合成元被细胞吸收并参与新衍生物合成。此外，后续工作还应包括新衍生物的分离和结构鉴定，以及生物活性评价。

本文按结构类别介绍MBS技术在微生物药物领域的研究应用，特别是近年来结合基因技术进行MBS研究的新进展。

1 突变生物合成在氨基糖苷类抗生素中的应用1～5]

氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物，但存在一定程度的肾、耳毒性。因此，对已有品种进行改造，开发对耐药菌有效、肾(耳)毒性相对较小的新品种一直是新药研究人员追寻的目标。20世纪70年代，人们利用MBS技术对氨基糖苷类抗生素进行改造，获得成功，特别是涉及2-脱氧链霉胺(2-deoxystrepta-mine，DOS)独需型阻断突变株的研究。如Rosi等通过诱变获得庆大霉素产生菌绛红色小单孢菌(Micromo-nospora purpurea)D-突变株后，添加链霉胺，生成2-羟基-庆大霉素，该化合物对含有2”-腺苷腺化酶的庆大霉素耐药菌有较强活性，毒性低，在临床上被广泛使用。这方面的研究Rinehart等曾进行过总结，本文不做详细叙述。

值得提出的是，20世纪80年代赵敏等通过诱变获得a位点(Fig.1)阻断的突变株JIM-401，该突变株代谢产物中庆大霉素C 2b (GM C2b )组分即小诺米星的产量大大提高，并实现工业化生产;再以JIM-401为出发菌株，获得c位点阻断的突变株JIM-202，该突变株的代谢产物中庆大霉素C1a (GM C 1a )的积累量大大增加(含量在85%以上)，在其2-脱氧链霉胺1-N位引入一个乙基，经半合成获得新化合物1-N-乙基庆大霉素C1a (etimicin，依替米星);再以JIM-202为出发菌 株，获得b位点阻断的突变株JIM121，其代谢产物中 西索米星(sisomicin)组分的产量大大增加。

目前，丁酰苷菌素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素、链霉素等氨基糖苷类抗生素的生物合成基因簇的研究取得了可喜的成就，这为利用MBS方法结合现代基因技术对氨基糖苷类抗生素进行改造提供了有利条件。

2 核苷类抗生素的MBS研究[6，7]

Nikkomycin是唐德链霉菌(Streptomyces tendae)Tü901产生的一种核苷肽类抗生素，与几丁质合成酶底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺有类似结构，竞争性抑制几丁质合成酶，干扰真菌细胞壁的合成，是一种低毒的抗真菌及杀虫剂。

尿嘧啶和4-甲酰基-4-咪唑啉-2-酮是nikkomycin生物合成途径中的两个中间体，分别对应Z和X组分。1984年，Delzer等通过诱变获得pyr - 突变株。该突变株不能合成以尿嘧啶为中间体的nikkomycin。添加23种N-杂环化合物进行MBS研究，其中胸腺嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶和5-氟尿嘧啶可被利用合成新的衍生物。

1999年，Bormann等采用基因工程方法进行MBS的研究，构建了L-赖氨酸-2-氨基转移酶失活突变株S.tendae nikC，该突变株不能合成nikkomycin I，J，X，Z肽基侧链的前体哌啶-2-羧酸，积累了nikkomycin的核苷成分。当添加吡啶甲酸时，可恢复产生nikkomycin I，J，X，Z;添加苯甲酸，获得Bx和Bz组分(如Fig.2所示)。Bx和Bz比X，Z有较高的pH稳定性，Bx对白念珠菌有更高的抑菌活性。

此外，Bormann等还构建了产nikkomycin LX 和L 的突变株，获得的新衍生物也显示出很好的抗菌活性。目前，nikkomycin产生菌分子生物学特性的研究已经取得了巨大的成就，通过MBS技术并结合基因手段，相信会有更多更优质的产品出现。

3 Clorobiocin的MBS研究[8，9]

Clorobiocin、新生霉素(novobiocin)和coumer-mycin(香豆霉素)是由链霉菌产生的一类具有抑制 DNA旋转酶活性的抗生素，同属于氨基香豆素家族，

Fig.2 MBS of nikkomycin 能够与细菌DNA旋转酶B亚基紧密结合，有效抑制该酶活性，实现抗菌作用。对氨基香豆素类抗生素的研究主要集中在clorobiocin和新生霉素，两者的结构如Fig.3所示，包括三个部分:ring A，3-异戊烯基-4-羟基-苯甲酰(3-prenyl-4-hydroxybenzoyl，DMAHB);ring B，3-氨基-4，7-二羟基香豆素(3-amino-4，7-dihy-droxycoumarin，ADHC);ring C，诺维糖(L-noviose)。2004年Galm等通过基因手段构建了clorobiocin产生菌异戊烯基转移酶失活突变株——cloQ - 。该突变株不能合成DMAHB前体。添加DMAHB类似物(如Fig.4所示)获得了28种clorobiocin衍生物。体外活性研究发现，新衍生物对大肠埃希菌DNA旋转酶抑制活性是新生霉素的50%～200%，但即使是活性最高的衍生物，其活性仅为clorobiocin的50%;对枯草芽孢杆菌ATCC14893的生长抑制活性比新生霉素和clorobiocin都低;大部分新衍生物对葡萄球菌均有效。

4 糖肽类抗生素的MBS研究

活性与万古霉素相当，但对厌氧菌尤其是梭状芽孢杆菌的抑制活性要高得多。因此，balhimycin具有很好的临床价值。

目前，对balhimycin等糖肽类抗生素的结构改造研究主要集中在非蛋白组成氨基酸，如β-羟基酪氨酸(Hty)、3，5-二羟基苯基甘氨酸(Dpg)和4-羟基苯基甘氨酸(Hpg)等。

2002年，Pek等第一次用MBS技术对balhimycin进行研究(Fig.6a)，删除过氧化氢酶基因bhp的一段序列，获得Hty合成阻断突变株。添加Hty，修复bal-himycin生产能力;添加外消旋3-氟-β-羟基酪氨酸合成了fluorobalhimycin;添加2-氟，3，5-二氟-β-羟基酪氨酸也合成了相应的fluorobalhimycins;D/L-酪氨酸以及酪氨酸酚羟基被氟取代或位置改变的类似物，未能掺入到新衍生物的合成，说明酚羟基的重要性。活性研究表明，所有的氟化balhimycin衍生物对枯草芽孢杆菌都有抑制活性。

2004年，Weist等删除Dpg编码基因dpgA的一段序列，获得Dpg合成阻断突变株。添加Dpg，修复balhimycin生产能力;添加4种单、双取代羟基、甲氧基的Dpg类似物(Fig.6b)均获得了新衍生物;通过添加实验，Weist等共获得20多种糖基化方式不同的衍生物。有趣的是，添加3-单取代-苯基甘氨酸，合成的新衍生物有一部分在7位Dpg和5位Hpg间缺少正常balhimycin的AB-环联芳键。 CDA CDA(calcium-dependent antibiotic)是由天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3产生的酸性脂肽类抗生素，其结构与达托霉素(daptomycin)类似，分子中有许多D-氨基酸和非蛋白组成氨基酸，与免疫抑制剂环孢菌素、抗肿瘤药物博来霉素和抗菌药物万古霉素同属于非核糖体合成肽(nonribosomal peptides)家族。CDA的结构如Fig.7所示，根据R 6 、R 9 、R10 和R 11 上取代基的不同，分为CD A 1b 、CD A 2b 、CD A 3b 、CD A4b 、CD A 2a 、CD A 4a 等组分。英国曼彻斯特理工 大学(UMIST)和Sanger研究所对CDA基因簇结构研究结果显示，82Kb的基因簇序列包含了至少40个开放阅读框(SCO3210-SCO3249)，并利用分子手段结合现代分离检测技术对各阅读框的功能和CDA的生物合成途径进行了研究和推理。

2002年，Hojati等利用分子生物学手段获得4-羟基-苯乙醇酸合成酶基因hmaS(SCO3229)被破坏的突变株，该突变株不能合成CDA分子重要的结构单元4-羟基-苯基甘氨酸(Hpg)。添加外消旋4-羟基-苯乙醇酸或4-羟基-苯乙醛酸或L-Hpg可恢复CDA的生产能力;添加苯乙醇酸、苯乙醛酸、苯酰甘氨酸类似物(脱羟基或羟基被卤元素取代)，获得了芳香侧链4位羟基被H取代的衍生物CDA 2d 和被F取代的 R6 R 9 R10 R11 CAD1b OH OPO3 H2 H H-H CAD 2a OH OPO3 H2 CH 3 π-bond CAD2b OH OPO 3 H2 CH3 H-H CAD3a OH OH H π-bond CAD3b OH OH H H-H CAD 4a OH OH CH 3 π-bond CAD4b OH OH CH3 H-H CAD2d H OPO3 H2 CH3 H-H CAD1ta F OPO 3 H 2 CH 3 π-bond CDA 2td F OPO3 H 2 CH3 H-H Fig.7 Structure of CDA analoguesCDA 2fd ;而添加4-氯苯乙醛酸以及含对氯和对甲氧基的类似物，均未得到类似CDA2fd 的衍生物。

5 聚酮类抗生素的MBS研究

5.1 Rapamycin(雷帕霉素)[20～23]

Rapamycin是由吸水链霉菌(Streptomyces hygro-scopicus)NRRL5491产生的31元大环内酯类免疫抑制剂，结构与FK506(tacrolimus，他克莫司)和immunomycin相似(Fig.8)。临床上主要用于自身免疫病和组织器官移植时产生的排异反应的治疗。

来源于L-赖氨酸的六氢吡啶酸是rapamycin聚酮环的重要组成结构。研究表明，rapL基因编码的RapL(赖氨酸环化脱氨酶)催化L-赖氨酸生成L-六氢吡啶羧酸。

1998年，Khaw等通过ΦC31噬菌体介导的基因置换使rapL产生移码突变，构建了RapL失活突变株LEK111。当用TSBGM完全培养基发酵培养野生型菌时，产生rapamycin和prolylrapamycin(脯氨酰雷帕霉素，L-脯氨酸取代L-六氢吡啶羧酸)，两者比例约为20∶1;同样条件下发酵LEK111，则产生少量rapamy-cin和prolylrapamycin，且prolylrapamycin的相对含量大大增加;添加L-六氢吡啶羧酸，产生rapamycin的量和野生型菌株几乎相当;添加L-反-4-羟脯氨酸，产生两种新的rapamycin类似物[4-羟脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin(4-hydroxyprolyl-26-demethoxy-ra-

pamycin)和4-羟脯氨酰rapamycin(4-hydroxyprolyl- rapamycin)];L-顺-4-羟脯氨酸、L-顺-3-羟脯氨酸也可以掺入到rapamycin中，但新物质结构未阐明;3，4-双羟脯氨酸和吡啶羧酸未能掺入到rapamycin中。体外活性顺序为rapamycin>脯氨酰rapamycin>4-羟脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin。

2001年，Chung等通过同源双杂交技术，获得一个rapamycin基因簇rapQONML被破坏的突变株，在添加六氢吡啶羧酸后，生成16-氧-去甲基-27-去甲氧基rapamycin，而非rapamycin。

2003年，Graziani等添加RapL的抑制物到野生型菌的发酵液中，进行类似MBS的研究，在添加噻嗪烷羧酸后，生成了含硫的rapamycin类似物。

Gregory等也曾采用基因手段对rapamycin产生菌进行MBS研究[23] 。

5.2 Enterocin(伏尔加霉素，恩特洛霉素)[24] Enterocin和wailupemycin是由Streptomyces maritimus产生的结构相似的抑菌剂，其生物合成途径如Fig.9所示。由encP基因编码的苯丙氨酸氨基裂合酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)对entero-cin和wailupemycin的起始前体苯甲酰CoA的合成起着决定性作用。

2003年，Kalaitzis等通过同源双杂交技术，删除了442bp的EncP序列，构建了PAL失活的S.mari-timus突变株XP。添加芳香酸(包括单取代苯甲酸、杂环芳香酸、1-烯-环己烷甲酸)，发现单取代苯甲酸中，只有对-氟苯甲酸可被利用，生成20-氟代enterocin、5-脱氧-20-氟代enterocin和19-氟代wailupemycin D～G;2-噻吩甲酸和3-噻吩甲酸以近似1∶2的比例掺入到enterocin和wailupemycin类似物分子中，但杂环化合物如呋喃酸(糖酸)、烟酸未能掺入;添加1-烯-环己烷甲酸，只生成了enterocin类似物;添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)基础上改造而来的芳香酰CoA硫酯的模拟物，只有苯甲酰-SNAC和2-噻吩甲酰-SNAC以很低的效率掺入到enterocin和wailupemycin G的分子中，而对-甲苯酰-SNAC和对-氯-苯甲酰-SNAC未被利用。这是Kalaitzis等第一次利用MBS技术对PKSⅡ型的大环内酯抗生素进行结构改造的研究。上述实验数据说明Ⅱ型PKSs对外源起始单元的耐受性相对较低，具体的机制还有待进一步的研究。

5.3 Erythromycin(红霉素)[25]

红霉素是1952年从红霉素链霉菌(Streptomyceserythreus)培养液中分离出来的碱性大环内酯类抗生 素，有A、B、C、D、E等组分。红霉素分子包括三部分:红霉素内酯(erythronolide)、去氧氨基己糖(desosa-mine)和红霉糖(cladinose)。

6-dEB(6-脱氧红霉素内酯)是红霉素合成途径中最早的中间体，在羟化酶的作用下，C-6位羟基化形成红霉素内酯参与生物合成。早期曾获得不能合成6-dEB的突变株2NU153，添加一系列的红霉素内酯类似物，合成了许多新的衍生物2] 。6-dEB是在聚酮合成酶(polyketide synthases)DEBS催化作用下，由丙酰-CoA和六个甲基丙二酰-CoA以类似脂肪酸合成的途径生成的。DEBS包括三个亚基:DEBS1、DEBS2和DEBS3，每个亚基包含两个模块，其中DEBS1还包含荷载域(loading domain)，DEBS3还包含一个硫酯酶TE;Pieper等研究表明DEBS1的荷载域对底物的特异性有较大的宽容性，除正常的丙酰-CoA外，还可以接受乙酰-CoA、丁酰-CoA和N-乙酰半胱氨酸(SNAC)硫酯等。Khosla等1997年通过分子手段使DEBS1酮基缩合酶失活，并构建质粒p JRJ2 ，通过质粒将6-dEB基因转移到异源宿主天蓝色链霉菌(Strep-tomyces coelicolor)中，获得工程菌CH999。添加SNAC-硫酯类似物，修复6-dEB的生产能力，并形成新衍生物。然后将这些新衍生物添加到Streptomyces erythreus发酵液中，通过生物转化作用，合成一系列erythromycin D的类似物(Fig.10)。研究发现，SNAC的稳定性和添加时间直接影响到MBS的成功与否及新衍生物的产量。

目前，对红霉素生物合成途径和基因簇的研究已经比较透彻，为合成新的衍生物提供了重要基础和有利条件。

5.4 Avermectin[26～32] Avermectins(AVM)是由除虫链霉菌(Strepto-mycin avermitilis)产生的具有杀昆虫、杀螨、杀线虫活性的16元大环内酯类抗生素，结构如Fig.11所示。AVM分子主要由两部分(十六元大环内酯环和L-齐墩果糖二糖)组成，根据C5、C22-23、C26位结构的不八个组分。AVM的起始单元来自L-Ile和L-Val，它们在支链氨基酸转氨酶的作用下生成α-酮酸，然后在支链氨基酸α-酮酸脱氢酶BCDH的作用下分别生成2-甲基-丁酰-CoA和异丁酰-CoA。在此基础上，进一步合成AVM a和b。早在1986年Bu′Lock等就通过诱变获得BCDH失活的突变株，利用MBS技术对AVM C25位上的结构进行改造。1991年，Hafne等详细介绍了采用NTG诱变获得BCDH失活突变株的过程，并获得性能稳定的突变株ATCC53568。之后，Dutton和Bu′Lock等利用ATCC53568进行了系统的MBS研究，添加800多种突变生物合成元，获得了36种新衍生物，均表现出很好的生物活性。其中，最重要的一个衍生物就是多拉克汀(doramectin)，它被认为是采用MBS技术合成的AVM家族中最优秀的成员。多拉克汀是在发酵培养BCDH失活突变株的过程中添加环己烷羧酸(cyclohexanecarboxylic acid，CHC)获得的。因为BCDH失活，不能利用L-Ile和L-Val为起始单元合成正常的AVM，CHC在脂酰-CoA合成酶的作用下，参与到新起始单元的合成。其结构如Fig.11所示，环己烷取代C25位上的原有结构。多拉克汀抗虫谱广、活性强，为极具开发潜力的抗虫新药。

1995年，Skinner等分别对BCDH的两个基因(bkdABC和bkdFGH)进行研究，发现F基因中断，添加2-甲基丁酸，只产生a组分。添加环己烷羧酸合成多拉克汀。

2000年，Croop等从S.collinus中克隆到一个能够合成环己烷甲酸-CoA的基因，并成功地将该基因导入Streptomycin avermitilis bkd突变株中，使合成的环己烷脂肪酸占总脂肪酸的49%。这样，在不添加环己烷甲酸的情况下也能产生多拉克汀。随后，Stutz- man-Engwall等通过插入失活、定点突变和错配PCR 等技术使aveC失活，获得CHC-B1 (多拉克汀)与CHC-B2 的比例增大4倍的突变株。经过上述改造获得的工程菌，其多拉克汀的产量大大提高，并应用于工业生产。

6 Siderophore的MBS研究[33]

Siderophore是微生物产生的一类低分子量的Fe离子螯合剂，具有很强的Fe离子亲和力，满足微生物对铁元素的需要。Phenolic是siderophore家族重要的成员之一，是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugi-nosa)产生的酚代side-rophore。水杨酸(salicylic acid)是phenolic生物合成的关键中间体。

1991年，Ankenbauer等构建了水杨酸合成阻断突变体Sal-IA602。Ankenbauer等添加13种水杨酸类似物到IA602的发酵液中，发现其中只有5-氟水杨酸(5-fluorosalicylic acid)、4-甲基水杨酸(4-methylsali-cylic acid)和3-羟基吡啶甲酸(3-hydroxypicolinic acid)可掺入到pyochelin类似物的生物合成中，并相应的生成5-氟pyochelin、4-甲基pyochelin和6-aza-pyochelin(Fig.12)。活性研究表明，三者都具有Fe离子运输活性，活性顺序为4-甲基pyochelin>Phenolic>6-azapyochelin>5-fluoro-pyochelin。

7 讨论

突变生物合成是在研究抗生素次级代谢途径的过程中兴起、发展和完善起来的。最初在氨基糖苷类抗生素中得到广泛应用。到目前为止，几乎涉及到抗生素的各个类别，特别是氨基糖苷类、聚酮类和多肽类，开发了许多优秀品种，如2-羟基庆大霉素、N-乙酰西索米星、多拉克汀和依替米星等。同时，也在非抗生素领域得到应用，如对siderophore和rapamycin衍生物的研究。

MBS的发展很大程度上决定于突变株的检出，在分子生物学技术应用于MBS以前，主要靠化学、物理诱变来获得突变株，这种方法具有很大的随机性，而且工作量大，限制了其发展。基因技术的发展使突变株的获得方式发生了巨大变化:直接改造药物的生物合成基因，有目的性和针对性地获得突变株。新阶段MBS研究的发展还得益于以下几个方面:①微生物次级代谢途径和基因簇研究的深入;②现代分离检测方法特别是HPLC-MS的应用;③突变合成元来源的扩大;④酶工程的发展。

作为产生微生物药物衍生物的重要手段，MBS有着巨大的发展潜力，主要体现在:①与半合成相比，污染少、成本低，而且有些衍生物不能通过化学方法制备;②新衍生物的发酵工艺、提取工艺、所需设备等与原品种相似或相近，甚至稍做改动便可实现工业化生产，具有很好的经济效益和社会效益;③微生物次级代谢途径和基因簇研究的深入，为MBS提供了更多的研究对象。

MBS技术更广泛地应用存在一些限制因素如:①尽管利用基因技术可以有目的的获得所需要的突变株，但由于酶的专一性，使得突变合成元的选择范围受到很大限制;②掺入量有限，给新衍生物的检测、分离和工业化增加了难度。针对这些问题，需要对产生菌进一步改造、对发酵条件进行优化、对提取分离检测方法进行改进。

MBS本身也存在一定的局限性，即MBS主要是对微生物药物的母体结构进行改造，为药物结构类似物的研究制备方法。

尽管MBS技术还存在这样那样的问题，许多优秀的衍生物品种，特别是多拉克汀的开发成功，无疑预示着其巨大的潜力。

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