脐静脉内皮细胞高表达内皮脂肪酶后其生物学特性的变化及意义

作者                       作者单位

方玉强 第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆市 400037  

黄岚   第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆市 400037

赵晓辉 第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆市 400037  

尹阳光 第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆市 400037

康华丽 第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆市 400037

邓梦杨 第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆市 400037

Effects of over|expressing endothelial lipase on the bionomics of human umbilical vein endothelial cell

FANG Yu　qiang, HUANG Lan, ZHAO Xiao　hui, YIN Yang　guang, KANG Hua　li, DENG Meng　yang

Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007,16(6):529

Abstract：Objective:To study the effect of endothelial lipase(EL) on the bionomics of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC).Methods: The HUVEC over|expressing EL (named HUVEC-EL) was got through transfection HUVEC with plasmid pcDNA4-EL-myc/His.Results: Compared with the normal HUVEC,after over|expressing EL, it was found that the ability and the speed of proliferation of HUVEC was slower(P<0.05),but after injury its ability of migration increased and the percentage of apoptosis increased(P<0.05).Conclusion:After over expression of EL, the bionomics of endothelial ce1ls is changed, and these changes may participate the pathophysiology of atherosclerosis.

Author′s　address：Department of Cardiology，Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing，400037，China

Key words：Lypase(EL);Endothelial cell;Cell proliferation;Cell apoptosis

内皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)是 1999年发现的，与甘油三酯脂肪酶，脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂肪酶(HL)共属脂肪酶家族[1]。EL由血管内皮细胞分泌并作用于血管内皮，具有较强的磷脂酶活性和较弱的甘油三酯酶活性，是高密度脂蛋白(HDL)代谢的关键酶[1]。在冠状动脉粥样硬化斑块的内皮细胞、平滑肌细胞和巨嗜细胞中均发现有EL表达[2]。研究发现EL可促进单核细胞与血管内皮细胞粘附，而此作用与酶促作用无关[3]。这些结果说明EL可能在冠心病的发生、发展中发挥了作用。我们的前期研究发现在冠心病患者的血液循环内皮细胞中存在EL表达，其EL阳性细胞比例与冠心病患者临床危险性呈正相关[4]，表明 EL的表达可能对内皮细胞的生物学特性有一定影响。为此，本研究利用质粒转染观察人脐静脉内皮细胞(HUVEC)高表达EL后自身部分生物学特性的变化，以期了解内皮细胞表达EL后的可能生物学意义。

1 资料与方法

1.1 主要试剂及动物来源

高表达EL质粒(pcDNA4EL-myc/His)由奥地利Harrachgasse医科大学分子医学中心分子生物和生化研究所Frank S教授惠赠，HUVEC细胞株购自ATCC(由第三军医大学微生物教研室彭涛博士惠赠)，脂质体(lipofectamine) 2000(货号11668-027)购自美国Invitrogen公司，Zeocin(一种抗肿瘤抗微生物的抗生素，可用作质粒的筛选标记，货号11006-33-0)购自美国Invitrogen公司，EL多克隆抗体购自Cayman公司(货号113354)。

1.2 高表达EL质粒对HUVEC的转化及鉴定

1.2.1 HUVEC的复苏及Zeocin敏感浓度的筛选：复苏冻存的HUVEC细胞，按Zeocin说明书进行HUVEC敏感浓度的筛选，经过多次验证，致HUVEC100%死亡的 Zeocin浓度为 90μg/ml，故转化筛选浓度设为 100 μg/ml，增加阳性克隆的筛选准确性。

1.2.2 高表达EL质粒(pCDNA4-EL-myc/His)转化HUVEC及阳性克隆子的筛选：按lipofectamine 2000说明书进行质粒 pcDNA4-EL-myc/His转化 HUVEC，以Zeocin浓度 100μg/ml进行阳性克隆筛选。并用 Western blot进行 EL表达鉴定，以获得稳定表达阳性克隆子，命名为 HUVEC-EL株。

1.3 HUVEC-EL增殖能力的检测(MTT法)

分别将处于对数生长期的 HUVEC和 HUVEC-EL消化，按1×103细胞/孔接种 96孔板，HUVEC-EL采用含 Zeocin(100 μg/ml)的培养基进行培养，HUVEC用普通培养基进行培养。每个时向点取 9个孔，于接种后2～68 h(间隔为4～6 h)采用MTT法测定细胞490 nm处的吸光度值，各个时向点取平均OD值反应细胞的增殖情况。

1.4 HUVEC-EL受损后迁移能力的影响(划痕法)

将处于对数生长期的 HUVEC和 HUVEC-EL消化，按 10×106细胞/孔接种 6孔板，待 6 h细胞完全贴壁后用灭菌1 ml加样头在培养孔中轴对贴壁细胞进行划线损伤，井吸去培养基和刮下的细胞，HUVEC换用正常培养基，HUVEC-EL换用含Zeocin(100 μg/ml)的培养基进行培养，并于不同时间观察细胞向损伤部爬行情况，测量爬行距离。

1.5 HUVEC.EL凋亡率的变化

将处于对数生长期的 HUVEC和 HUWC-EL消化，以 10× 106细胞/孔接种 24 孔板，分别于培养后 8、16、24、32、40、48 h进行细胞凋亡检测，记录细胞调亡率。

1.6 统计学处理

组间资料比较采用独立样本q检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 高表达EL内皮细胞株的建立

经Zeocin筛选EL阳性的HUVEC细胞株与空白HUVEC细胞进行过夜培养，提取细胞蛋白进行Western检测，结果见EL阳性HUVEC细胞(命名为HUVEC-EL)能表达EL，而空白HUVEC不能表达EL。

2.2 HUVEC高表达 EL后增殖能力的变化(MTT法)

MTT法检测高表达EL对HUVEC生长曲线的影响如图1。可见高表达EL后HUVEC(EL-HUVEC)生长速度减慢，增殖能力减弱(P<0.05)。

2.3 EL高表达对HUVEC受损后迁移的影响(划痕法)

结果如图 2(原始放大倍数100倍)。可见损伤后经质粒转化高表达EL的HUVEC较正常细胞的迁移能力增强(P<0.05)。

2.4 EL高表达对HUVEC凋亡率的影响

如图3。经过培养后HUVEC和HUVEC-EL均有不同程度的凋亡，但高表达EL的HUVEC细胞凋亡率较正常HUVEC的凋亡率高(P<0.05)。

3 讨 论

EL以磷脂酶活性为主，主要水解 HDL，而 LPL和 HL易水解富含甘油三酯的脂蛋白。研究发现EL由内皮细胞表达，且于局部发挥作用，其表达量在胚胎内皮细胞中呈现高水平，而后随发育成熟呈下降趋势，成年后主要在冠状动脉、胎盘、甲状腺、肝、肺、肾、睾丸和卵巢等组织中可以检测到 EL mRNA[5]。

研究[6]发现EL是HDL代谢的关键环节，抑制EL活性可增高HDL|C水平，但EL还存在许多非酶作用：通过氨基酸序列中的疏水区直接与脂蛋白结合，介导脂蛋白与细胞的相互作用[8，9];促进循环单核细胞与血管内皮发生粘附，并调节单核细胞渗透到病变组织中[3]。正常血管内皮细胞表达极低水平的EL，但促进动脉粥样硬化的物理因素、内毒素、高脂饮食及促炎因素白介素( IL)-1β、和肿瘤坏死因子(TNF) -α等可引起内皮细胞 EL表达上调[7]。这些说明EL可引起内皮细胞变化而引起或促进动脉粥样硬化。但对内皮细胞高表达EL后其自身部分生物学活性的变化却研究甚少。为此我们采用质粒转染技术使HUVEC高表达EL，并与正常HUVEC进行比较，发现HUVEC高表达EL后其增殖能力明显减弱，生长速度降低，但迁移能力增强，凋亡率增加。

尸解[2]证实在人冠状动脉粥样硬化损伤局部的内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞表面有EL表达;Badellino等[9]研究发现代谢综合征患者血中 EL浓度明显高于正常人群，并且与冠状动脉粥样硬化(AS)的发生呈正相关。我们的前期研究也发现：无冠心病危险因素人群冠状窦循环内皮细胞(CEC)无EL表达，有危险因素或病变者的CEC存在EL表达，且随患者临床危险性增加而增强。EL阳性CEC占总循环内皮细胞的比例[EL+CE(%)]与高敏C反应蛋白(hsCRP)、CEC计数及改进的冠脉病变危险分数密切相关。这些研究结果提示EL可能与AS的发生与发展有关。本研究结果提示在AS损伤发生后，其周边表达EL的内皮细胞往受损区迁移较正常内皮细胞快，但迁移到病损区的内皮细胞却因生长慢且凋亡增加而不能象正常内皮细胞那样尽快覆盖病损区，使之再内皮化，从而使病损区较长时间暴露于致栓因子下，导致血栓形成和粥样硬化形成，从而引起再狭窄和 AS的发生发展。

【参考文献】

[1]Jin WJ, Sun GS, Marchadier D, et al. Endothe1ial cells secrete triglyceride 1ipase and phospho1ipase activities in response to cytokines as a result of endothelia1 lipase[J]. Circ Res，2003, 92:644-650.

[2]Azumi H, Hirata K, Ishida T, et al. Immunohistochemical localization of endothelial cell|derived 1ipase in atherosclerotic human coronary arteries[J].Cardiovasc Res，2003,58: 647-654.

[3]Kojma Y, Hirata K, Ishida T, et al.Endothe1ial lipase modulates monocyte adhesion to the vessel wall. A potential role in inflammation[J]. J Bio1 Chem，2004, 279: 54032-54038.

[4]方玉强，黄 岚，宋耀明，等.循环内皮细胞中内皮脂肪酶的表达与冠心病患者临床表现的关系[J].中华老年心脑血管病杂志，2006, 8(6):812-814.

[5]Broed1 UC, Jin WJ, Rader DJ. Endothelial Lipase: A Modulator of lipoprotein metabo1ism upregulated by inf1ammation[J]. Trends Cardiovasc Med,2004, 14:202-206.

[6]Khalil MF, Wagner WD, Goldberg IJ. Molecular interactions leading to 1ipoprotein retention and the initiation of atherosc1erosis[J].Arterioscler Thronb Vasc Biol,2004, 24:2211-2218.

[7]Jaye M,Krawiec J. Endothelial lipase and HDL metabolism[J].Curr Opin Lipidol,2004,159: 183-189.

[8]Fuki IV, Blanchard N, Jin WJ, et al. Endogenously produced endothelial lipase enhances binding and cellular processing of plasma lipoproteins via heparan sulfate proteoglycan|mediated pathway[J]. J Biol Chem,2004, 278:34331-34338.

[9]Badellino KO, Wolfe ML, Reily MP, et al.Endothelial lipase concentrations are increased in metabolic syndrome and associated with coronary atherosclerosis[J].PloS Med,2005, 3:e22.