基因生物起搏研究近况

作者                    作者单位

朱明星 辽宁医学院附属第一医院心血管病研究所，辽宁 锦州 121001

刘仁光 辽宁医学院附属第一医院心血管病研究所，辽宁 锦州 121001

Recent Researches on Genetically Biological PacemakersZHU Mingxing, LIU Renguang

(Institute of Cardiovascular Disease, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract: With the development of the Human Genome Project research, molecular biology has been developed enormously, which also provides the basis and developing opportunities for cardiac biological pacemakers. In this paper, recent researches on genetically biological pacemakers are reviewed.

Key words: cardiac biological pacing; pacemakers; gene biological pacing

近年来提出的心脏生物起搏是指利用生物学及其相关技术，对机体受损的自律性节律点或传导障碍的传导系统进行修复或替代，使机体心脏自身的起搏和传导功能得以恢复。生物起搏具有神经体液调节反应，并可避免电子起搏器的反复更换、电极脱落、囊带感染和血肿以及心肌穿孔、心包积液并发症等缺点，已成为治疗缓慢心律失常研究的热点。生物起搏尚处于起蒙阶段，目前的研究主要基于两方面：(1)细胞生物起搏;(2)基因生物起搏。本文就基因生物起搏的机制和研究近况作以简述。

1 基因生物起搏机制

基因生物起搏治疗是应用基因工程、细胞生物学技术及心肌生物电产生机制，对受损的自律性细胞或发生传导障碍的特殊传导系统的细胞进行基因修复、替换和基因产物的补充或阻断，即将功能正常的基因转移到功能异常的细胞中;或用一些专门的基因技术修饰心肌细胞，使心脏中的非起搏细胞具有自律性，成为病人心脏中新的起搏点，替代受损的窦房结或房室结;或是将干细胞移植同时结合转基因技术，增强起搏电流来发挥起搏点的作用[1-3]。基因起搏治疗主要包括三方面：(1)转染超极化激活的环核苷酸门控(HCN)基因，形成超极化激活的阳离子流，引起心肌细胞自动去极化，具有起搏功能[4];(2)转染kir2.1基因(转运编码内向整流电流IK1 1个α亚单位)，使得普通心肌细胞转化为起搏细胞[5];(3)利用基因工程技术转染β2肾上腺素受体的互补DNA，下调内向整流电流，使自律性心肌细胞高表达起搏电流，形成生物起搏[2]。

2 转染内源性起搏电流基因

起搏细胞的电生理特性在于其动作电位结束时能够自动去极化，即产生舒张期去极化，而产生舒张期去极化的电生理基础是内源性起搏电流(If)。因此，上调心肌细胞内的If编码基因的表达即有可能使心肌细胞产生自律性。

2.1 HCN编码基因分型

HCN共分为四个亚基，有三个亚基在心脏，即超极化环核苷酸门控阳离子通道1(HCN1)、超极化环核苷酸门控阳离子通道2(HCN2)、超极化环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)。HCN高度表达的心肌细胞可产生If样起搏电流，能够触发心脏搏动[6]。

2.2 HCN编码基因与自律性

If由HCN基因家族及Min-K相关肽(MiRP1)共同调控，HCN、MiRP1分别构成通道的α、β亚单位。其中HCN调节起主要作用，MiRP1起辅助作用，能够增强If的表达[7]。Ludwig等[8]研究认为HCN2和HCN4通道共同参与If电流的形成，其中HCN2参与If电流快成份的形成，HCN4则参与If电流慢成份的形成。敲除动物HCN基因的研究表明，HCN2亚型的生理功能在于稳定静息状态下起搏细胞的舒张期膜电位，从而起稳定起搏节律的作用;而HCN4对产生正常起搏电位和基础率至关重要，且参与交感神经对心率的调节作用。杨新春等[9]研究也表明在HCN4基因被敲除的小鼠胚胎心脏中记录不到具有4期自动除极特征的起搏细胞动作电位。

2.3 转染HCN基因

2003年Qu等[10]进行了生物起搏研究，他们将起搏电流基因的亚单位(HCN2)转染犬左心房，抑制窦房结后心电图表现出起源于左心房的心律。这种过度表达起搏电流的心肌细胞对细胞内的cAMP有反应，对生理性调节细胞内cAMP的β肾上腺素和毒蕈碱拮抗剂也有反应，表明这种生物起搏可以受自体神经激素的调节。Potapova等[11]应用转染了心脏起搏基因mHCN2同时表达绿色荧光蛋白的人类间质干细胞(hMSCs)，与大鼠心室肌细胞联合培养后出现了搏动，且频率高于对照组,频率比为(161±4)VS(93±16) bpm(P<0.05);注入犬左室壁原位，在窦性停搏时，同样表现出自发搏动节律[频率实验组快于对照组,(61±5)VS(45±1) bpm, P<0.05)]。

李继文等[12]用含HCN4基因的重组腺病毒AdHCN4感染心肌细胞，结果心肌细胞产生自发搏动频率，提示HCN4基因有可能成为治疗缓慢性心律失常疾病的目的基因。 等[13]应用细菌内同源重组法构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体(Ad-HCN4)，注入到Yorkshire猪左心室游离壁，结果猪左室性心律频率明显加快，用无水乙醇消融Ad-HCN4注射区后该心律消失，证实该心律起源于Ad-HCN4注射区。Ad-HCN4转染心肌细胞可表达较大的If，表明腺病毒介导HCN4通道基因心室局部高表达发挥了生物起搏器的作用，且使用异丙肾上腺素后表现出正性变时性作用，说明生物起搏器具有受自体神经体液因素调节的优点。

Huang等[14]研究窦房结细胞的HCN2和HCN4转录水平随年龄而不同(P<0.001)，成年大鼠HCN2的转录比幼鼠时下降了近70%(P<0.05)，然后保持相对稳定在余下的生命阶段(年龄：3.53±0.38;P<0.05)HCN4转录减少了21%(P<0.05)，结果表明，HCN通道可能构成与年龄有关窦房结功能下降的一个重要因素。Plotnikov等[15]通过制造一个含有N-和C-末端的大鼠HCN2和大鼠跨膜区HCN1嵌合通道(HCN212)并把它植入11只犬的左束支，所有犬在植入(0.9±0.3)天后迅速发展为室性心动过速(VT)[心室率>120 bpm，最高频率=(285±37) bpm]，并持续到(5±1)天。

3 抑制kir2.1基因

3.1 kir2.1分子生物学特性

Garneau等[16]研究发现人kir2.1通道蛋白具有拓扑结构，其一级结构包括13个半胱氨酸残基，7个分布在N端和C端区域，位置分别在43、54、76、89、122、154和311。膜片钳结果显示除了C76和C311，其他部位的半胱胺酸单个突变为丝氨酸后，没有显著影响单通道的传导和通道的开放概率。76位的半胱胺酸突变为解离的或不解离极性的氨基酸残基后，导致通道的活性缺失或者通道的开放概率下降。311位的半胱胺酸突变为丝氨酸或精氨酸或丙氨酸后，引起通道平均关闭时间的增加和出现长的关闭时间，关闭时间间隔>500 ms，且通道复活的敏感性降低。这些改变与kir2.1和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)相互作用减弱有关，C311R和C311S的突变比C311A的突变更能明显的调节kir2.1-PIP2的相互作用[17]。

3.2 kir2.1基因与自律性

kir2.1是心肌细胞中内向整流钾通道(kir)家族的重要成员之一，其编码基因为KCNJ2。内向整流钾电流(IK1)通道是由kir2.1基因家族编码的只允许内向钾电流通过，而在窦房结细胞缺乏这种电流。研究表明，成人心室肌细胞也具有起搏的潜能，正常情况下被IK1抵制，这种钾通道的整流有利于维持心肌细胞的静息电位和参与动作电位的后期复极过程[18]。近年来，大量的动物实验及临床研究认为，KCNJ2基因mRNA水平在心房颤动患者中明显增高，且随心房颤动发作时间的延长增高越明显[19]。

3.3 抑制kir2.1 基因表达

Silva等[20]发现心室肌细胞的IK1电流抑制达81%后就表现出自发性的动作电位，这时的钠钙交换体(INaCa)成为心室肌细胞的起搏电流，而且随着IK1电流抑制率的增加，心室肌细胞的内在起搏频率也增加，并且这种心室肌细胞还对β受体激动剂有反应。Miake等[21]应用基因替换技术将编码IK1的kir2.1基因中的3个氨基酸残基替换为丙氨酸并将该突变体整合到腺病毒载体上，抑制kir2.1基因表达，然后注入到豚鼠左心室，3～4 天后，其中80%的IK1电流受到抑制，心脏通过4期自动去极化产生自主节律电活动(室性自主心律) ，同样发现下调心脏工作细胞的IK1可使其产生起搏电位。李凡东等[22-23]通过构建抑制大鼠心肌细胞kir2.1基因的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒(pEGFP6-1kir2.1)，转染到体外培养的大鼠心室肌细胞，结果，转染48 小时后，实验组细胞出现自主搏动频率。因此抑制心室肌细胞的IK1电流制造生物起搏是一种可靠的途径，但是也带来早搏增多及复极延长等[16]负面影响。

4 β2肾上腺素受体过度表达

心脏传导系统与其他任何部位相比具有丰富的肾上腺素能神经支配，使得窦房结具有丰富的β2肾上腺素受体，β2肾上腺素受体通过G蛋白耦联的信号传递系统调节心肌的变时、变力作用。交感神经兴奋释放儿茶酚胺类递质与β2肾上腺素受体结合后使cAMP 与HCN通道受体结合，产生较快的膜除极化作用并使心率加快。通过将表达β2受体的cDNA导入心肌细胞内，使心肌细胞膜的β2受体过度表达，增加自律细胞对内源及外源性肾上腺素的反应以提高心率。Edelberg等[24]人将编码β2肾上腺素受体基因的质粒注射到猪的心房肌内，48 小时后，出现心房节律，实验组的心率比对照组快50%。

目前对β2肾上腺素受体在生物起搏方面的研究并不多，其存在的主要问题如下：(1)通过β2肾上腺素受体过度表达提高心率仅能持续3～4 天，如何获得长期上调的β2肾上腺素受体同时减少由于高表达的β2肾上腺素受体而增加的其他疾病风险;(2) β2肾上腺素受体是一种提高心率的非特异性刺激物，其作用不仅仅是作用于起搏电流而且作用于其他的儿茶酚胺敏感性电流，因而β2肾上腺素受体过度表达可能是有害的[25];(3)作为表达β2肾上腺素受体的cDNA腺病毒载体也存在着致病的危险。

5 展 望

目前基因生物起搏尚处于动物实验阶段，以病毒为载体进行基因治疗，本身存在安全质疑。为实现有效、安全的生物起搏，近来有的实验采取复制-缺陷腺病毒的策略，使病毒DNA保持一种染色体外的状态，以避免遗传物质整合到宿主基因组中;还可以采用联合治疗的策略，移植转基因后的干细胞治疗;通过组织工程学技术构建新的窦房结等。心脏生物起搏可以避免人工起搏的诸多缺点，并能适应自主神经调节，随着研究的深入和技术与方法的不断完善，基因生物起搏治疗将可望成为一种新兴的治疗缓慢型心律失常的方法。

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