DNA-PKcs 表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系

作者              作者单位

曲颂   530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院

朱小东 530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院

黎丹戎 530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院

张玮   530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院

曹骥   530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院

Relationship between the Expression of DNAPKcs and Radiosensitivity in Nasopharyngeal Carcinoma Cell Lines

QU Song，ZHU Xiaodong，LI Danrong，ZHANG Wei，CAO Ji

Department of Radiation Oncology，Cancer Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

Abstract：Objective This study was designed to determine the relationship between expression of DNAPKcs gene (a catalytic subunit of DNAPK,which is an important component in NHEJ pathway) and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell lines. Methods Radiosensitivity parameters of nasophryngeal carcinoma cell lines were obtained by the colony forming assay and irradiation dosesurvival curve were done by linear quadratic model. The two cell lines were exposed to 60Coγ ray and received 4Gy, 12 hours later, the survival rate were obtained by MTT assay, and evaluated the different radiosensitivity of two cell lines. After receiving different irradiation dose, the dynamical changes of the expression of DNAPKcs in mRNA level of CNE1 and CNE2 were detected by RTFQPCR. Results Survival rate of CNE1 was higher than those of CNE2 at each dose point. Mean inactivation dose was higher in CNE1(2.78) than that in the CNE2(1.61),and the SF2 was 0.627 and 0.341 respectively. After exposed to irradiation dose of 4Gy，survival rate in CNE1 was also higher than that in the CNE2. The ratio of relative expression of DNAPKcs in the two cell lines was 7.54±2.71(t=4.17，P=0.014). The expression of DNAPKcs in CNE2 was correlated with the irradiation dose and postirradiation time. Conclusion CNE2 is more radiosensitive than CNE1. The expression of DNAPKcs gene is correlated with the radiosensitivity of nasophryngeal carcinoma.

Key words：Nasopharyngeal carcinoma cell line;RTFQPCR;DNAPKcs;Radiosensitivity

0 引言

放射治疗是治疗鼻咽癌的主要手段，但临床上患者对放射敏感性存在个体差异，因此，放射治疗前即对放射敏感性作预测性分析是目前放射生物学研究的课题之一。DNAPKcs是DNA依赖蛋白激酶(DNAPK)的催化亚基，属于PI3K激酶家族，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性[1，2]，参与DNA双链断裂缺口的修复。由于细胞的放射敏感性与照射后DNA双链断裂损伤修复的关系密切[3]，近年来已有研究证明DNAPKcs催化亚基可能与肿瘤细胞的放射敏感性有关。本实验通过对不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2照射前后及照射后不同时间DNAPKcs基因表达的检测，探讨其与鼻咽癌放射敏感性的关系，为临床上从基因水平对NPC放射治疗进行干预提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

CNE1(人鼻咽癌高分化鳞状细胞癌细胞)及CNE2(人鼻咽癌低分化鳞状细胞癌细胞)由本院中心实验室提供，培养条件为含10%小牛血清及青、链霉素的RPMI1640培养基， 5%CO2孵箱37℃孵育。

1.2 照射条件及方法

采用加拿大THERATRONICS780C 60Co远距离治疗机, 剂量率为108 ～111cGy/min，源皮距80cm，调整细胞上方培养液深度为5mm，以此作为60Coγ射线照射所需剂量建成区。

1.3 照射细胞存活曲线

设0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、16Gy剂量点, 取上述指数生长期细胞，用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液细胞消化后制成悬液,以102的密度接种细胞于直径6cm培养皿中,待细胞贴壁后照射。照射后细胞继续培养10～14天，待出现可见集落时终止培养，弃培养液，甲醛固定，姬姆萨染色，计数细胞数>50个以上的集落数，每个剂量点设3个平行样本。计算细胞存活率，计算机按线性二次模型(LQ模型)拟合，绘制细胞存活曲线，求PE、α、β、SF2、MID值。

1.4 MTT法检测单次照射后细胞存活率

96孔板接种细胞,每孔104个,每个时间点设6孔，培养48h后单次照射4Gy。未照射和照射后细胞在5%CO2 孵箱37℃孵育后，分别于照射后3、6、12、24、36、48h以10∶1的体积加MTT (5mg/ml)，作用4h后吸弃培养液，每孔加0.2ml的DMSO使细胞裂解,37 ℃孵育待紫色固体凝粒溶解均匀后，酶标仪测OD490值。用各时间点的OD值除以培养48h未照射对照组的OD值得到各时间点的存活率。

1.5 细胞总RNA抽提及cDNA制备

取上述对数生长期细胞，以105的密度接种于100ml培养瓶中，行0～16Gy照射后12h采用小量柱离心式细胞总RNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)提取细胞总RNA，具体操作步骤详见说明书。按照MMLV 反转录试剂盒(MBI公司)说明书操作合成cDNA 模板。

1.6 引物的设计与合成

根据GenBank中GAPDH和DNAPKcs的mRNA序列，由Primer 3在线设计，上海生工生物技术有限公司合成，各引物序列设计如下：GAPDH(GI：7669491)F：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，R：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGT3′，扩增片断长度225bp;DNAPKcs(GI：13570016)F：5′ATCTCTTAAAGCGGGCCTTCG3’，R：5′AGGCATCAACTCAGGGACTGG3′，扩增片断长度239bp。

1.7 逆转录荧光定量聚合酶链反应(RTFQPCR)

采用iCycler iQTM实时PCR检测仪(BIORAD公司)进行PCR 扩增及结果分析。用未经照射的CNE2细胞的cDNA制备标准品，等比稀释为100、101、102、103、104、105浓度。反应体系25μl：10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl2 2μl、dNTP 2μl、Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司) 2U、上、下游引物各10pmol、20×SYBR Green I染料(上海捷瑞生物工程有限公司)1μl及cDNA 1μl。将上述成分混匀后,于PCR仪上进行扩增, GAPDH和DNAPKcs的扩增条件为94 ℃变性30s，67℃退火30s，72 ℃延伸45s。共反应40个循环,在每一循环的退火温度时收集荧光进行实时检测。所用荧光的激发波长为488nm，发射波长为520nm。在PCR 后进行熔解曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，温度以0.5℃/10s的速率从50℃缓慢递增到100℃，相当于在520nm处连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。

1.8 统计学处理

采用SPSS11.5统计软件包，照射前CNE1、CNE2细胞DNAPKcs相对表达量的结果采用两组均数的t检验，4Gy照射后不同时间及0～16Gy照射后12h的相对表达量采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 细胞存活曲线

由线性二次模型(LQ模型)拟合的剂量存活曲线见图1，CNE1、CNE2细胞的放射生物学参数α(Gy1)值分别为0.059、0.323，β(Gy2)值分别为0.068、0.071，SF2值分别为0.627、0.314，MID(Gy)值分别为2.78、1.61，可知CNE2细胞的内在放射敏感性明显高于CNE1细胞。

2.2 4Gy照射后不同时间CNE1、CNE2细胞存活情况

4Gy照射12h后CNE1细胞存活率为88.2%，CNE2细胞存活率为72.3%，经t检验有显著差异(t=5.759，P=0.005)，见图2。结合结果1说明：照射后CNE2细胞无论是间期死亡还是增殖死亡均较CNE1细胞增加，CNE2细胞较CNE1细胞对射线更敏感。

2.3 RTFQPCR实验结果

通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的特异性，见图3，结合熔解曲线分析可知DNAPKcs在CNE1、CNE2细胞中均有表达，见图4。结果显示CNE1细胞的DNAPKcs相对表达量为CNE2细胞的7.54±2.71(t=4.17，P=0.014)，从图5、6可见0～16Gy照射后12h及4Gy照射后不同时间CNE1、CNE2细胞中DNAPKcs相对表达量的变化，其中CNE2细胞的DNAPKcs表达具有时间和剂量依赖关系(相关系数分别为0.945、0.983，P=0.005、0.001)。

3 讨论

放射线导致细胞损伤的主要靶点是DNA，由放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致的DNA单链和双链断裂损伤，其中以DNA双链断裂(DSB)损伤最为重要。DSB可通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)实现修复，DNAPK是哺乳动物细胞中参与NHEJ主要的分子途径之一，是由Ku70、Ku80以及DNAPKcs三亚基组成，其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基[4]，在DSB修复中起着辨认、结合和排列DNA末端并招募催化亚基DNAPKcs的作用，任意一个组分缺陷均会导致DNAPK活性丧失，而导致放射敏感性增加。国内外已有文献报道用针对DNAPKcs的反义核酸可提高胶质瘤细胞、Hela细胞的放射敏感性 [5，6]。

Beamish等 [7]研究发现DNAPKcs基因突变将导致小鼠产生重症联合免疫缺陷病，细胞对电离辐射敏感性增加。有的研究表明DNAPKcs表达缺陷的胶质瘤细胞对放射线敏感，而其正常表达的胶质瘤细胞则对射线抗拒 [8]。以上均说明了DNAPKcs与放射敏感性有着密切的联系。为了研究DNAPKcs基因的表达是否与鼻咽癌放射敏感性有关，我们首先采用克隆形成实验并由线性二次模型(LQ模型)拟合剂量曲线，验证了本实验室保存的CNE2(人鼻咽低分化鳞癌细胞株)的放射敏感性高于CNE1(人鼻咽高分化鳞癌细胞株)，通过RTFQPCR的方法检测两株细胞中DNAPKcs基因的表达差异及与时间、剂量的依赖关系，发现DNAPKcs在CNE2中的表达明显高于CNE1，此外DNAPKcs在CNE2细胞中还存在与剂量和时间的依赖关系，即随着照射剂量的增加和单次照射后时间的增加其表达量也增加。为何DNAPKcs只在CNE2细胞株中存在剂量与时间的依赖关系，这是我们所要解释的问题，分析原因有以下几种可能性：其一，DNAPKcs在CNE1细胞中表达量较高，其表达量不因DNA损伤出现较大的波动;其二，DNAPK是p53的上游激活因子 [9]，可能与p53所处的功能状态有关，而本实验尚未对此进行深入研究;其三，目前只从mRNA水平检测DNAPKcs的表达，尚未得到蛋白水平表达差异的证据;其四，可能还存在其他调控因素的协同作用。

综上所述，笔者认为DNAPKcs是决定鼻咽癌DNAPK功能比较重要的亚基，其催化功能在射线照射后引起的DSB修复中发挥着较为重要的作用，调控着DNAPK的活性，可为早期筛选放射敏感的鼻咽癌患者以及对鼻咽癌进一步的放疗增敏临床研究提供可靠的理论依据，有关DNAPKcs与鼻咽癌放射敏感性的关系还需要进一步的深入研究来证实。

【参考文献】

[1]Jackson SP.The recognition of DNA damage [J]. Curr Opin Genet Dev， 1996，6(1): 1925.

[2] Bailey SM，Brenneman MA，Halbrook J，et al.The kinase activity of DNA PK is required to protect mammalian telomeres [J]. DNA Repair (Amst), 2004, 3(3): 225233.

[3] McKay MJ, Kefford RF.The spectrum of in vitro radiosensitivity in four human melanoma cell lines is not accounted for by differential induction or rejoining of DNA double strand breaks [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，1995，31(2):345352.

[4] Jeggo PA.Identification of genes involved in repair of DNA doublestrand breaks in mammary cells [J]. Radiat Res，1998，150(suppl)：580591.

[5]Daido S，Yamamoto A，Fujiwara K，et al. Inhibition of the DNAdependent protein kinase catalytic subunit radiosensitizes malignant glioma cells by inducing autophagy [J].Cancer Res，2005，65(10):43684375.

[6] 余子建，孙敬芬，隋建丽，等.DNAPKcs反义核酸增强HeLa细胞对辐射及化疗药物顺铂的敏感性 [J].中国现代医学，2005，15(8)：11481151.

[7]Beamish HJ，Jessberger R，Riballo E，et al.The Cterminal conserved domain of DNAPKcs，missing in the SCID mouse, is required for kinase activity [J]. Nucleic Acids Res,2000,28(7):15061513.

[8] Ai R，Sandoval A，Labhart P. Different Differential gene expression in human glioma cells:correlation with presence or absence of DNAdependent protein kinase [J]. Gene Expr，2003，11(1)：3545.

[9] Woo RA，McLure KG，LeesMiller SP，et al.DNAdependent protein kinase acts upstream of P53 in response to DNA damage [J].Nature，1998，394 (6694):700704.