HSV-TK基因靶向治疗与放射治疗联合应用的研究进展

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谭祥　四川，泸州医学院附属医院肿瘤科

1 HSV-TK/GCV的作用机制

HSV-TK发挥对肿瘤细胞的杀伤作用主要体现在直接抑制肿瘤生长和旁观者效应两个方面。

1.1 直接抑制肿瘤生长

HSV-TK基因能将无毒性的核苷酸类似物转化成有毒性的物质，常用的核苷类似物来源于嘌呤核苷，包括无环鸟苷(aeyclovir，ACV)及其衍生物GCV。将HSV-TK基因转导入肿瘤细胞后， 能够催化GCV磷酸化生成一磷酸丙氧鸟苷(GCVMP)，并在细胞内磷酸激酶的作用下形成三磷酸丙氧鸟苷(GCVTP) ，而GCVTP的细胞毒性最强，能抑制细胞内DNA聚合酶的作用，从而抑制其DNA合成，还能够插入DNA链中，引起碱基配对错误、DNA断裂、姐妹染色单体交换和致死性基因失稳定，从而导致肿瘤细胞死亡。GCV对HSV-TK基因修饰的肿瘤细胞抑制作用比ACV强10倍，所以GCV成为TK基因转染肿瘤细胞后最常用的药物。有研究证明转入TK基因后再予以GCV治疗，主要杀伤细胞周期在S期的细胞。

1.2 旁观者效应

旁观者效应(bystander effect，BSE)指自杀基因不仅能引起转染细胞凋亡，还可以杀伤未导入基因的邻近细胞。1986年Moolten等首先观察到在转导了TK基因的肿瘤细胞与未转导的肿瘤细胞按一定的比例混合培养，加入GCV后，两者都能被杀死，旁观者效应克服了基因转导率低的缺点，大大增强了肿瘤杀伤作用。目前一般认为旁观者效应的可能机制有：(1)缝隙连接(gapjunctions，GJ)：通过细胞之间缝隙连接，将毒性代谢物扩散到邻近细胞。也有研究发现在细胞彼此不接触情况下存在的远程旁观者效应。(2)细胞凋亡：凋亡细胞形成的凋亡小体被周围细胞及吞噬细胞内吞。但有的研究研究者在“旁观者”效应中没有发现典型的细胞凋亡，可能与细胞种类有关。(3)免疫介导：坏死细胞释放细胞因子诱导免疫反应。有研究表明免疫功能正常鼠比裸鼠的“旁观者”效应更明显，证明T细胞在旁观者效应中起重要作用。(4)血管内皮损伤：内皮细胞损伤导致肿瘤组织缺血坏死。

2 HSV-TK的靶向治疗研究

所谓基因的靶向治疗就是靶向基因表达，是将目的基因置于靶向性组织的细胞特异行启动子或增强子下，只有特定组织，细胞的转录因子才能与这些启动子作用，并激活转录，从而实现目的基因的选择性表达。靶向基因治疗肿瘤可以通过靶向基因导入和靶向基因表达来实现。

2.1 HSV-TK载体

如何实现目的基因的有效转移，是基因治疗的关键。现在基因转移的方法有两大类：一类是非感染方法，另一类是病毒载体介导的感染方法。非感染方法包括DNA注射、基因枪法、多聚赖氨酸或阳离子脂质体包裹DNA法等，该类方法较安全，但效率低，外源基因表达时间短。目前TK基因用于恶性肿瘤的基因治疗研究的载体都用病毒类载体，包括逆转录病毒载体、腺病毒载体腺、腺相关病毒载体等，其中最常用的是逆转录病毒载体，其次是腺病毒载，但病毒类载体也存在潜在的致畸，突变等风险。

2.2 HSV-TK的靶向治疗

2.2.1 HSV-TK与组织或肿瘤特异启动子联合靶向治疗

有研究者[1]用5'-UTR修饰的HSV-TK(HSV-UTK)有效的限制肿瘤细胞表达eIF4E，提高肿瘤细胞特异性基因的表达，增加GCV对癌细胞的细胞毒性，具有较强的靶向性。研究发现[2]在85%的小细胞肺癌细胞株中有高水平INSM1(insulinoma-associated 1 )启动子的表达，INSM1启动子驱动的HSV-TK基因能够显著增加小细胞肺癌细胞株对GCV的敏感性，其荧光素酶表达量是SV40启动子的10倍。HSV-TK还可以做为放射诱导的靶向治疗，将HSV-TK基因与早期生长因子-1启动子(Egr-1, early-growth response-1)连接，碘131(I-131 lipiodol )作为内源性放射源，发现放射活性只选择性的在肝肿瘤组织聚集。体内实验联合GCV和碘131治疗，实验组的肿瘤全部消退，且无任何副作用[3]。hHKII(human hexokinase II)启动子对不同类型的小细胞肺癌有特异的靶向性，联合HSV-TK/GCV能够特异的杀伤非小细胞肺癌细胞，比起对照组疗效具有显著的差异性[4]。PSCA(Prostate Stem Cell Antigen)启动子驱动HSV-TK基因联合GCV治疗前列腺癌，体外实验表明仅在使用PSCA启动子的前列腺癌细胞中发现有荧光素酶表达，体内实验中经GCV治疗后证明具有特异的诱导细胞毒性的能力，并对GCV具有浓度依赖性，而对非前列腺癌细胞只有极小的作用[5]。有研究者[6]构建了pVLTR-tk质粒并将其转入EBV-LMP1(EBV-latent membrane protein 1)阳性细胞中治疗与EBV相关的癌，经GCV治疗后显著降低细胞存活率和集落形成率，并观察到了旁观者效应，体内实验中LMPI阳性细胞显著的调亡，肿瘤生长被抑制，证明pVLTR-TK对EBV-LMP1阳性癌细胞具有较强的靶向性，为治疗EBV相关的癌提供了一种新的靶向治疗策略。

2.2.2 HSV-TK对肿瘤血管的靶向治疗

有研究者[7]将HSV-TK基因转导进内皮祖细胞(EPC-TK)与脐静脉内皮细胞U87，U251按不同比例混合并给予GCV治疗，发现不但能够杀死大多数内皮祖细胞，还能以比例依赖和时间依赖的方式杀死脐静脉内皮细胞，并在体内实验中观察到明显的肿瘤生长抑制。修饰的鼠前内皮素原启动子PPE-1(3X)能够特异的诱导肿瘤血管床的表达，比正常肺组织的血管床表达高35倍，以腺病毒为载体联合HSV-TK基因(AdPPE-1(3X)-HSV-TK)及GCV的体内实验能够有效的诱导肿瘤细胞坏死，凋亡和单核细胞渗出。导致肺转移瘤大量的新生血管结构破坏，抑制肺转移瘤的发生[8]。表达HSV-TK基因的逆转录病毒在ppET1(specific prepro-endothelin-1)启动子控制下能够将HSV-TK靶向传递到肿瘤血管内皮细胞，GCV治疗后导致乳腺癌或者结肠癌肿瘤血管大量破坏，肿瘤细胞凋亡，肿瘤减小，动物的存活时间增加。当联合化疗时效果更显著[9]，国内有研究者[10]构建了AdKDR-tk质粒，体外实验证明能够有有效的靶向杀伤血管人类脐静脉内皮细胞(存活率：28.94%±5.67%)，体内实验AdKDR-tk/GCV组显著降低微血管密度，抑瘤率为24.5%,证明AdKDR-tk对肿瘤血管具有靶向性。

3 HSV-TK联合放射治疗研究

放射治疗是肿瘤治疗的主要手段之一，约70%的肿瘤病人需要接受放射治疗，当放射治疗与自杀基因联合应用时，对肿瘤产生双重杀伤效应，实现对自杀基因体内表达的时空调控。同时，自杀基因提高肿瘤对放疗的敏感性，抗肿瘤效果比单用基因治疗扩大数倍。一些研究证明放疗和HSV-TK/GCV联合应用，能够显著增强抗肿瘤效应，降低放疗和基因治疗潜在的毒副作用。

3.1 单自杀基因联合放疗

研究发现γ射线能够提高DNA第二链的合成，增强转基因表达以及HSV-TK/GCV自杀基因系统的杀细胞效应。国内有研究者[11]将HSV-TK基因转导进宫颈癌HeLa细胞中，给予400cGy的钴60射线照射，单纯基因治疗对细胞生长的抑制率为45.8%，单纯放疗的抑制率为42.4%，而基因治疗与放疗联用的抑制率为87.5%，克隆形成率明显下降，具有显著统计学差异。体内实验给予20Gy照射，单纯基因治疗与放疗对HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为39.5%和35.8%，而联合治疗的抑瘤率达到87.9%，放射增敏比为3.2，提示HSV-TK/GCV具有放疗增敏作用，证明二者联合可以作为宫颈癌综合治疗的有效补充方法。有研究者[12]构建了Ad-PPE1-3x-TK，联合GCV能够特异性的杀伤肿瘤血管内皮细胞。联合放疗肿瘤体积比未放疗组体积显著的减小，肿瘤中心出现大量坏死(55%～80%)和凋亡以及较多的肉芽组织，而未放疗组仅可见少量坏死。另外，联合放疗还能引起肿瘤血管形态改变而不诱导肝毒性发生，显著延长实验动物存活时间。

3.2 双自杀基因联合放疗

研究证实不同自杀基因之间的相互联合可以大大提高协同抗瘤作用和应用价值。有研究者构建了E.coliCDglyTK融合基因质粒，研究证实双自杀基因联合放疗不但具有放射增敏作用还可以提高自杀基因的活性，并广泛的应用于癌症的自杀基因治疗。有学者[13]将CD-TK融合基因转进腺样囊性癌ACC-2细胞中(ACC-2/CD-TK)，单独或者给予40 μg/ml 5-fluorocytosine (5-FC) 和 0.1 μg/ml GCV48小时后给予不同剂量的钴60放射治疗,ACC-2/CD-TK组放射增敏比为2.313,克隆形成率比对照组显著的降低。有研究者[14]将TK，CD融合自杀基因转入结肠癌SW480中，发现GCV和5-Fc对放疗均有放疗增敏效应，但是两者联合比单独给予任何一种前体药物的放射增敏效应大得多。另外，有研究者提出，TK基因和其它自杀基因联合的协同抗瘤作用大小与给予前体药物的时间，顺序[14、15]以及载体[16]也有关。

3.3 自杀基因与放射诱导启动子联合放疗

将TK基因与一些放射诱导启动子结合并联合放射治疗肿瘤也取得了很好的疗效。有研究者[17]利用HRE(hypoxia responsive element)构建了HRE-Egr嵌合启动子，驱动HSV-TK基因，将其转染进人腺癌细胞A549中，低氧下给于GCV和2Gy的γ射线照射，含HRE启动子的A549细胞比对照组细胞HSV-TK表达量高7倍，对GCV的敏感性增加55倍。TUNEL分析发现HRE-Egr-HSV/TK转染的人腺癌细胞在低氧下给予GCV和放疗后能够显著的增加细胞的凋亡，诱导并增强肿瘤低氧-特异细胞毒性。体内试验中HRE-Egr-HSV/TK组肿瘤比对照组肿瘤体积明显的减小，在治疗结束后疗效至少能够维持3周以上。也有研究者[18]单独利用Egr-1启动子驱动HSV-TK基因(AdEGR.TK)将其转入鼠横纹肌肉瘤R1H细胞中并给于6Gy的照射，HSV-TK基因表达量比对照组高1.8倍，给于GCV和6Gy的照射后肿瘤细胞的存活率比对照组低一倍。证实AdEGR.TK不仅能够显著增加细胞杀伤率，而且经放射线诱导后获得显著的增强。国内也有学者[19]将具有放射诱导性的c-fos基因启动子与诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)相耦联，构建放射诱导的一氧化氮(Nitric Oxide,NO)同步放大基因电路。利　　用该正反馈基因电路调控目的基因HSV-TK在瘤细胞中持续、高效表达，从而了达到高效、特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

4 展 望

HSV-TK/GCV系统在体内外实验中已取得令人振奋的结果，但仍存在许多问题有待解决，如发现并设计更高效更安全的基因转运载体，提高基因的靶向表达，加深对旁观者效应机制的研究等，如何加强HSV-TK/GCV系统与其他治疗方法的有机结合，提高疗效，更值得深入研究。总之，随着肿瘤基础研究的不断深入和一些新技术出现，关键问题得到逐步解决，HSV-TK/GCV系统必将在恶性肿瘤治疗中发挥更大作用。，从而成为人类医治肿瘤的重要手段。

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