磷酸羟基哌喹对血液系统辐射损伤保护作用的实验研究

作者              作者单位

张荣侠  泰兴市人民医院肿瘤科，江苏泰兴225400

杜秀平  徐州医学院附属医院肿瘤科，江苏徐州221002

Experimental study of the protective effect of hydroxypiperquin phosphate onematological system injury induced by radiation exposure in miceZHANG Rongxia1, DU Xiuping2*(1. Department of Oncology, Taixing People′s Hospital, Taixing, Jiangsu 225400, China;2. Department of Oncology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College， Xuzhou, Jiangsu 221002)Abstrsct: Objective To investigate the protection effect of hydroxypiperquin phosphate (HPQP) on hematological system injury induced by radiation damage in mice. Methods 40 male Kunming mice were randomly divided into five groups (low/middle/high dose groups, blank control group and normal group). All except the normal group underwent whole-body γ-ray irradiation at 4.5 Gy. The peripheral leukocyte and platelet counts were determined for the primary effect on hematological system to screen out the most suitable dose of the drug. Meanwhile, another 24 mice were randomized into 3 groups (drug treatment group, control group and normal group), which underwent gastrogavage at the previously determined optimal dose of HPQP prior to irradiation at 9.0 Gy γ-ray except the normal group. All the mice were sacrificed 9 days after radiation, and the effects of the drug on the hematopoietic function were evaluated by spleen colony method, bone marrow nucleated cell counts and observation of the bone marrow pathology. Results Hydroxypiperquin phosphate can promote the post-radiative restoration of peripheral leukocytes to a normal level (P<0.01) in mice, decreased mortality (P<0.01), and markedly increased colony-forming unit-spleen (CFU-S) and bone marrow nucleated cell counts (P<0.01). Conclusion Hydroxypiperquin phosphate has protective effect on the radiation-induced damage in mice; mice

Key words: hydroxypiperquin phosphate; radiation damage; hematological system; bone marrow; mice

磷酸羟基哌喹是一种人工合成的4-氨基喹啉类衍生物。最早应用于抗疟疾和驱虫，近年有人发现它可以预防和治疗尘肺。王梅等[1]发现该药可以防治放射性肺损伤，减轻照射引起的肺部病理变化，延缓放射性肺纤维化的进程。近年来该药的新作用不断被人们发现，但它对血液系统的放射防护作用，经检索国内外文献，目前尚未见有关报道。本实验研究磷酸羟基哌喹对小鼠血液系统辐射损伤是否具有保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料 磷酸羟基哌喹：125 mg/粒，第二军医大学523研究室科研产品。取1粒磷酸羟基哌喹用生理盐水溶解配成10 g/L、20 g/L，40 g/L的混悬液，备用;健康昆明小鼠，雄性，体重21～25 g，10～12周龄，由徐州医学院实验动物中心提供;DMEM培养液购自Gibco公司，小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司;血细胞自动分析仪、钴机由徐州医学院肿瘤研究所提供，离心机购自深圳尚能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 40只昆明小鼠随机分为5组(每组n=8)，磷酸羟基哌喹按人体有效剂量换算为小鼠剂量为65 mg/kg，分低、中、高(50 mg/kg，100 mg/kg，200 mg/kg)3个剂量组、空白对照组和正常组。除正常组外，所有小鼠给予4.5 Gy 60Co-γ射线全身照射，每次1.5 Gy，每天1次，剂量率0.26 Gy/min，源皮距75 cm。照射前2天开始，用药组分别灌服不同剂量的磷酸羟基哌喹，每周2次，灌服量0.1 ml/20 g，同时空白组灌服等体积生理盐水，正常组正常进食饮水;照射后1周、2周分别尾静脉采血，行外周血白细胞、血小板计数。并观察其行为、体重等生活状态，初步观察对血液系统的影响，并确定磷酸羟基哌喹的最适剂量。

另取24只昆明小鼠，随机分成3组(给药组、对照组、正常组，每组n=8)。以此前确定的最适剂量于照射前2天开始灌胃给药，每周2次;对照组给予等体积的生理盐水，健康组正常进食饮水。小鼠给予9 Gy 60Co-γ射线全身照射，每日1次，每次3 Gy，连续3天;照射后第9天处死小鼠。

1.2.2 脾结节计数(CFU-S) 方法参照文献[2]，取脾固定于Bouin液，24 h后计数脾脏表面结节数，1个脾结节代表1个造血干细胞集落。

1.2.3 骨髓病理组织观察 一侧股骨脱钙，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察骨髓病理学改变。

1.2.4 有核细胞计数 取另侧股骨及双胫骨，以注射器抽取DMEM培养液冲出全部骨髓，分散成单细胞悬液，沿管壁小心平铺在淋巴细胞分离液面上，离心、洗涤细胞，以DMEM重悬，混匀，台朌蓝染色，计数活有核细胞数并计算每根股骨中的有核细胞数。

1.3 统计学处理 所有数据以±s表示，采用单因素方差分析，用SPSS 13.0软件进行统计分析。

2 结 果

2.1 小鼠体重等变化 照射前小鼠体重各组间差异无显著性。所有小鼠行动敏捷，毛色光滑，照射后对照组体重下降幅度大，回升缓慢，瘦弱，精神较差，行动迟缓，毛色不光滑;照射后2周各组小鼠体重均有回升，精神好转、活动增多，所有小鼠无一只死亡。

2.2 外周血白细胞、血小板计数 见表1。

2.3 脾结节和有核细胞计数 见表2。表1 磷酸羟基哌喹对4.5 Gy辐射小鼠1周、2周后外周血白细胞、血小板计数的影响与对照组比较：★P<0.01，☆P<0.05;与正常组比较：▲P<0.01，△P<0.05表2 磷酸羟基哌喹对9 Gy60Co-γ射线辐射后d9小鼠脾结节、有核细胞计数的影响与对照组比较：★P<0.01;与正常组比较：▲P<0.01

2.4 骨髓病理组织学观察 骨髓病理切片显微镜下观察显示，对照组小鼠骨髓增生明显减低，骨髓基质水肿，大片出血，有核细胞减少甚至消失，呈骨髓衰竭状态;用药组小鼠骨髓增生活跃，有核细胞多，以中性粒细胞为主，表明磷酸羟基哌喹可以刺激小鼠骨髓造血，促进白细胞恢复。见图1。图1 照射后9天小鼠骨髓病理石蜡切片(苏木精-伊红染色，×400)

A.对照组; B.磷酸羟基哌喹组; C.正常组

3 讨 论

辐射可以导致机体各系统的损伤，骨髓是辐射高度敏感组织，电离辐射后常引起造血功能低下甚或衰竭，造血严重抑制;白细胞、红细胞和血小板数明显减少，从而诱发感染、贫血、出血等并发症。实验发现：小鼠接受Co-γ射线全身照射后，照射组小鼠外周血白细胞、血小板明显降低，预防给予磷酸羟基哌喹，可促进辐射损伤小鼠外周血白细胞、血小板的恢复，降低死亡率。

脾结节计数是最早、最经典的造血干细胞的测试手段。它能代表动物经照射后体内存活的造血干细胞的水平。因此，脾结节计数可间接反映残存造血干细胞的增殖分化能力，提示骨髓辐射损伤的重建恢复能力。所以脾结节计数是观察抗辐射药物疗效的可靠方法。而骨髓有核细胞计数是反映骨髓损伤的敏感指标。在照射第9天时，造血功能开始恢复[3]，因此，本实验观察了第9天的各项指标。实验结果显示:9 Gy照射后小鼠脾结节数和有核细胞数均以磷酸羟基哌喹组最高，该组有核细胞数甚至超过正常组，进一步证明磷酸羟基哌喹可以促进髓外造血，促进白细胞增生。提示该药对外周血象的保护作用一方面可能是通过促进骨髓造血干细胞的分化、增殖而实现的。

通过骨髓病理组织学观察，发现用药后骨髓造血细胞增生活跃，由此推测该药保护血液系统的作用可能是通过促进骨髓造血实现的。对骨髓的作用可能是通过与抗疟不同的机理实现，有待进一步研究证实。本实验结果表明：磷酸羟基哌喹可有效刺激受照后小鼠骨髓粒系造血，防止感染，在放射治疗前使用，可以有效地防治放射性血液系统损伤，保护造血系统。

磷酸羟基哌喹是一种人工合成的4-氨基喹啉类衍生物，临床用于抗疟疾，预防和治疗尘肺等[4]，有人发现该药可以通过保护肺巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮及血管内皮细胞而减轻炎症反应，从而对放射性肺纤维化有一定防治作用，可以延缓放射性肺炎的进程[1]。

近年来辐射防护药物研究已取得瞩目的成绩，但是仍然存在很多问题，主要问题是药物的毒性，其次是药物的稳定性、有效时间、用药途径等[5]，且价格昂贵。鉴于目前辐射防护药物的使用现状，寻找新的理想的辐射防护药物是急待解决的问题。磷酸羟基哌喹用于治疗疟疾，已有数十年临床使用经验，药理和毒副作用非常明确，副作用小[6]，用于抗辐射损伤治疗实为老药新用，一药多用，具有安全、价廉、服用方便、来源广泛、易为临床接受等优点，有望成为辐射防护药物较理想的替代品。

【参考文献】

1] 王梅,傅强,闵碧荷,等.磷酸羟基哌喹对放射性大鼠肺纤维化的防治作用[J].中国癌症杂志,2002,12(6):519-521.

[2] 徐文清,高文远,沈秀,等.银耳多糖注射剂保护辐射损伤小鼠造血功能的研究[J].国际放射医学核医学杂志,2006,30(2):114-116.

[3] 周永,糜漫天,杨镇洲.三羟异黄酮对照射小鼠造血系统损伤的防护作用[J].中华放射医学与防护杂志,2002,25(1):21-24.

[4] 陈月龙.磷酸羟基哌喹二级预防及早期治疗尘肺的临床观察[J].航空航天医药, 2003,14(1):57-58.

[5] 丁桂荣,郭国祯.抗辐射损伤药物的研究现状[J].辐射研究与辐射工艺学报,2007,25(6):321-324.

[6] 苟锦博,冯子键,李华忠,等.磷酸哌喹用于人群疟疾预防服药的副反应调查[J].中国热带医学,2008,8(4):541-543.