间充质干细胞在急性辐射损伤治疗中的应用前景

作者                 作者单位

李明    北京放射与辐射医学研究所， 北京 100850

王立升  北京放射与辐射医学研究所， 北京 100850  

罗庆良　北京放射与辐射医学研究所， 北京 100850

Abstract Mesenchymal stem cells are a kind of nonhematopoietic adult stem cells with selfrenewal and multilineage differentiation potential, which have special biological characteristics, such as secreting hematopoietic growth factors, reconstructing hematopoietic microenvironment, low immunogenicity, and can be transfected and expressed by exogenous gene. This article summarizes the biological characteristics of MSCs and their models of application to acute radiation disease in animals.

Key words Mesenchymal stem cell; acute radiation injury; radiation accident

在现代生活中，核能与核技术被广泛应用于核能发电、地质勘探、工业探伤、医疗照射、辐照灭菌等领域，然而由于违规操作、管理不善等原因，核/辐射事故时有发生。据国际原子能机构(IAEA)统计，自1940-2002年2月全球共有423起重大辐射事故，涉及133 840人，135人因此致死[1]。此外，核恐怖袭击或核战争条件下均可产生大量急性放射病(acute radiation sickness, ARS)人群。造血干细胞移植和造血生长因子应用是治疗重症放射病的主要措施，然而传统治疗手段的局限性迫使人们寻找新的行之有效的方法。近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)以其独特的生物学特性受到学者们青睐，它具有分泌造血生长因子、重建造血微环境、低免疫原性、易于外源基因转染和表达等优点，将其应用于急性辐射损伤的临床治疗具有十分广阔的前景。

急性放射病治疗研究现状

近年来，重组人造血生长因子如粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、血小板生成素(TPO)、白介素11(IL11)等成功地应用于骨髓造血功能抑制治疗，为中度和重度ARS的救治开辟了新途径。然而，绝大多数重症ARS患者在度过急性期后，仍会出现出血、感染乃至多脏器功能衰竭(MOF)等严重并发症，最终导致死亡。究其原因，一方面是由于目前应用的造血生长因子绝大多数仅能促进定向干/祖细胞的增殖和分化，而对多能干细胞作用甚微，虽能导致外周血细胞的短期升高，但缺乏较长期的作用;虽能使患者度过"骨髓无功能期"，但不能实现造血功能的长期重建。另一方面，如果仅增加患者的白细胞，未达到受损免疫系统的恢复和免疫功能的重建，患者仍会因免疫功能低下或异常所致的各种的感染而死亡[2]。此外，由于造血生长因子是通过刺激造血干/祖细胞起作用的，如果受照者体内残存的造血干/祖细胞不足1%，即使应用大剂量的造血生长因子也不会起治疗作用，所以造血生长因子治疗作用仅局限在一定照射剂量范围内。

当ARS患者受照射剂量达到造血损伤难以或不能自身恢复时，就需要进行骨髓等造血干细胞移植。然而，由于骨髓配型较困难、移植后严重的GVHD以及放射性间质性肺炎等并发症[3]，骨髓移植的临床治疗效果不容乐观。据最新统计，29例接受骨髓/外周血造血干细胞移植的事故性过量照射病例没有1例长期植入，且24%患者产生移植物抗宿主病(GVHD)。所以造血干细胞移植治疗剂量窗口狭窄，仅可治疗只有致死性骨髓损伤而没有其他器官的致死性损伤的病例，即极重度偏轻的骨髓型急性放射病。另外，ARS是一种全身性疾病，机体受到大剂量射线照射后，几乎所有的组织、器官、系统均可发生损伤，而我们目前的治疗手段多集中在造血重建上，所以临床上所有重症ARS患者经造血干细胞移植后，尽管造血功能得到重建，最终仍死于MOF[4]。如国内4例接受骨髓或外周血干细胞移植的事故性照射(>10Gy)病人，3例移植成功，但在照射后25-90天全部死于MOF。

MSC的多向分化潜能

MSC经体外诱导可以分化为中胚层的骨髓基质细胞，甚至跨胚层，分化为外胚层的神经元样细胞及内胚层的肝细胞等。体外扩增的MSC植入体内后可长期存活，仍保持其多向分化潜能，并且在损伤环境下还可以被诱导扩增，参加组织修复或者再生反应。Jiang等[5]将MSC植入免疫缺陷NODSCID小鼠体内，通过免疫荧光法检测证实MSC可以长期存在于骨髓、外周血、脾、肝、肺和小肠，低剂量照射使射线敏感组织如造血系统、胃肠道的植入率提高，提示MSC在辐射损伤治疗方面可能起一定作用。另外，Chapel等[6]用造血干细胞联合标记MSC治疗经中子加γ射线8 Gy全身不均匀照射的短尾猴，移植后82天仍可在损伤的肌肉、皮肤、骨髓、肠道等组织检测到标记细胞的存在。Devine等[7]对幼年狒狒进行致死剂量照射，然后输入自身或异体MSC进行治疗，结果解剖发现平均16个组织恢复。经RTPCR分析，在其所检测到组织中胃肠道MSC的植入量最高，肾脏、肺、肝脏、胸腺、皮肤中也有相对较高的含量，可达0.1%-2.7%。Francois等[8]给全身照射NOD/SCID小鼠输注人MSC(hMSC)后，发现在照射鼠脑、心、肝、骨髓和肌肉等组织中hMSC的植入量较未照射小鼠增加，而在局部+全身照射模型中，局部损伤部位hMSC的植入量明显增加。除此之外，还发现局部照射部位以外的器官中hMSC的植入量也增加了，这说明hMSC存在远位效应。由此可知，MSC体内回植后仍保持其多向分化潜能，并且能够迁移定居到损伤组织，参与损伤修复，提示对重症急性辐射损伤后多脏器损伤有一定的治疗作用。但其对于损伤修复的机理尚不清楚，是与损伤细胞融合还是转分化为相应组织的细胞，这些问题还有待进一步研究。

MSC的造血调控作用

MSC可分泌多种造血相关因子，如IL6、7、8、IL11、IL12、IL14、IL15、Flt3L、SCF、LIF、GCSF和GMCSF等[9]，输入MSC后可以补充辐射所致的体内细胞因子相对不足。MSC是骨髓基质中的主要干细胞，是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞。输注MSC由于其增殖分化成相应基质细胞，因此可修复辐射对骨髓基质细胞和造血微环境的损伤[10]，利于造血重建。给致死剂量照射狗自体移植外周血来源的造血干细胞(HSC)与体外扩增的经GFP标记的MSC，其造血功能得到了良好的重建，6个月后通过PCR和RTPCR在骨髓中检测到了GFP标记的MSC来源的基质细胞[11]。同时，MSC与HSC共移植可促进巨核系重建，明显增加巨核细胞和血小板数[12,13]，这将有益于改善重症ARS患者的出血并发症。MSC对HSC具有肯定地扩增作用，移植MSC可以促进HSC的植入。Devine[14]在狒狒的动物实验中发现，自体、同种异体MSC与HSC共移植均可长期植入受体骨髓。联合移植MSC弥补了HSC单独移植不能长期植入的缺点，对ARS的治疗提供了新的途径。另有文献报道，不论是骨髓还是外周血干细胞移植，受者骨髓的MSC都来源于自身[15,16]，表明受者体内的MSC具有辐射抗性。Chen等[17]分别以具有辐射抗性的人肺癌细胞系A549和辐射敏感的乳腺癌细胞系HCC1937为阴性和阳性对照，证实了MSC的辐射抗性。既然MSC具有辐射抗性，那么预先输注MSC是否具有辐射防护作用，此问题还需深入探讨。

MSC的免疫调节作用

事故性照射总是不均匀的，这使患者体内部分淋巴细胞逃避了死亡，供者骨髓中一定比例的淋巴细胞会视受者组织为异物而产生移植物抗宿主反应(GVHR)或抗宿主病(GVHD)，最终导致移植失败。迄今尚无1例>10Gy全身照射ARS长期成活的临床报道。前苏联切尔诺贝利核事故中13例(5.2-13.4 Gy)照射后4-16天进行了异基因骨髓移植，除2例照射剂量分别为5.6和8.7 Gy病人的骨髓自身恢复外，其余11例均死于并发的皮肤、肠道、间质性肺炎或急性、慢性GVHD[1]。MSC独特的免疫学特性将有利于这一问题的解决。MSC不表达MHC Ⅱ分子和Fas L，不表达或极低水平表达MHC Ⅰ分子，也不表达共刺激分子B71、B72、CD40、CD40L[18]，预示着MSC植入后不会引起或引起极低的免疫排斥反应。体外实验显示，在混合淋巴细胞反应(MLR)的初始或第3天，加入狒狒的MSC能够抑制进行中的MLR，使得增殖活性下降50%以上[19]，为MSC的异体移植提供了可能性。MSC移植入体内后是否会减轻造血干细胞移植引起的GVHD还存在争议。有的学者认为MSC可以起到该作用。有病例报道，1例20岁高危AML女患者经清髓处理后成功接受了她父亲HLA不匹配的外周血CD34+造血干细胞及骨髓来源的MSC，并未出现GVHD，移植后31个月无白血病复发[20]。但最近一项在小鼠体内的研究表明，MSC和骨髓共移植与单纯骨髓移植组比较，不论GVHD发生率还是在其严重程度方面均无显著差异。MSC植入体内后对于供者T细胞分裂没有抑制效应[21]，因此MSC与HSC共移植是否可以减轻GVHD还有待商榷。

易于外源基因转染和表达

MSC除具有以上特性外，还易于外源基因的转染和表达，且MSC所携带的外源基因表达具有明显的组织特异性。MSC基因转染的实验研究才刚刚兴起，目前国内外尚无基因转染MSC治疗ARS的相关报道，但其在刺激造血方面已取得了初步成效。deRevel等[22]将携带有IL1α基因的逆转录病毒载体转染骨髓基质细胞，然后输注到猕猴体内，未观察到临床毒性，且在第10天观察到白细胞数增加，提示这种基因治疗方法达到了刺激造血的目的。上述实验为重症ARS治疗提供了新思路。考虑到MSC的外源基因表达组织特异性，可以将作用于不同组织器官的细胞因子基因转染MSC，然后同时输注给急性辐射损伤患者以防治多器官功能损伤，然而这些细胞之间是相互协同还是拮抗或者可否减少细胞用量还有待深入研究。

问题与展望

随着对MSC研究的逐步深入，多国学者纷纷提出要把MSC作为急性辐射损伤治疗的新方法[23,24]。我们认为，MSC在放射损伤治疗中的应用研究才刚刚起步，仍有许多问题亟待解决：诸如损伤修复的确切机理，结合传统的ARS治疗方法，即应用细胞因子和间充质干细胞联合治疗或细胞因子基因转染MSC治疗ARS的效果，MSC联合HSC共移植对GVHD的影响等，这些问题都有待进一步研究。随着MSC在ARS模型中应用研究的深入，上述问题将会取得新的突破，有望为急性放射病的治疗开辟新的途径。

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