低剂量辐射后小鼠血清的蛋白质组学研究

作者                作者单位

李薇   吉林大学第一医院血液肿瘤科,长春,130021

张一琼 吉林大学第一医院血液肿瘤科,长春,130021

王冠军 吉林大学第一医院血液肿瘤科,长春,130021

王杰   国家医学生物分析中心,北京,100850

张学敏 国家医学生物分析中心,北京,100850

Serum Proteome in Mice after Low Dose Radiation

LI Wei，ZHANG YiQiong，WANG GuanJun, WANG Jie1, ZHANG XueMin1

Deptartment of Hematology and Onocology, The First Clinical Hospital of Jilin University, Changchun 130021 China; 1National Center of Biomedical Analysis,Beijing 100850,China

Abstract This study was purposed to investigate the mechanism of low dose radiation (LDR) by proteomic technology and to find the key proteins of the hormesis and adaptive response induced LDR, which provided the foundation of experimental and theoretical basis for the clinical application of LDR. Twodimensional electrophoresis (2DE) was used to screen protein patterns of normal serum and serum of mice exposed to LDR in different time for qualitative and quantitative differences in protein expression. And the differentiallyexpressed proteins between the two groups were identified by matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flightmass spectrometry (MALDITOFMS). The result showed that among the differentiallyexpressed proteins between the group exposed to LDR and the control group (shomirradiated group), it was found that after LDR new 4 proteins appeared, 13 proteins were upregulated, 6 proteins were downregulated, 3 proteins disappeared in the group exposed to LDR. In different time the quantity of some proteins was different, the protein expression had some characteristics, the estrogen receptor 2 was downregulated, the vitamin Dbinding protein and apolipoprotien were upregulated in the group exposed to LDR. It is concluded that LDR upregulate or downregulate some proteins, some proteins related with LDR were found. It may provide some new explanations for the effect mechanism of the LDR.

Key words proteome; low dose radiation; twodimensional electrophoresis; mass spectrum

J Exp Hematol 2007; 15(1):191-194

近十几年来，低剂量辐射的生物学效应的发现具有重要的实际意义，人们将其生物学效应分为两大类，一是兴奋效应，二是适应效应。然而，目前对其作用机制尚不十分清楚。已有人证明，低剂量辐射后，松果体及免疫细胞的某些膜抗原、信号蛋白、周期蛋白等发生变化，继而间接或直接地产生免疫刺激作用[1-3]， 但是，国内外有关低剂量辐射对造血系统作用机制的研究报道还很少。随着蛋白质组学研究的兴起及其研究技术的开发和完善，从细胞蛋白质总体水平研究生命的活动规律已成为可能，蛋白质是生命功能的直接载体，蛋白质翻译后加工对功能的影响意义重大，而该领域的研究为基因组所不及。因此，用蛋白质组学方法对低剂量照射组及假照组的血清蛋白质表达差异进行分析，有利于发现与低剂量辐射作用机制有关的蛋白，从细胞整体水平上动态地研究低剂量辐射对造血系统的作用机制，为低剂量辐射的临床应用提供实验依据和理论基础。

材料和方法

昆明雄性小鼠体重(20±2)g，均购自本校动物部。共120只，随机分为两组：每组60只，一组为假照射组，另一组给予75 mGy的X线照射，分别于照射后24 、 48 、 72小时处死。 每个时间点分别处死照射组小鼠20只，对照组小鼠20只。

照射条件

深部X 线发生机,电压200 kV,电流10 mA,滤板0.5 mm Cu + 1.0 mm Al,全身照射,靶源与皮肤距离212 cm ,剂量率12. 5 mGy/ min。

样品的制备

在处死小鼠前，每只小鼠给予腹腔注射2.5 ml 肝素，2分钟后进行眼球后动脉取血 。将血浆436×g离心，取上清，去掉红细胞，再经2 280×g转高速离心取上清，基本去掉血小板。每组将20只小鼠的血清混合，用 Bradford法定量后按一次银染或考马斯亮蓝染色的量分装，-70℃保存备用。

双向凝胶电泳

用双向凝胶电泳(2DE)[4]方法进行细胞蛋白质的分离，利用银染和考马斯亮蓝染色方法进行电泳凝胶染色。

凝胶图像采集与分析

染色后的双向电泳凝胶用凝胶图象扫描仪(Amersham Pharmacia Biotech)扫描。数字化图像文件采用Nonlinear Dynamics公司的二维电泳处理软件(ImageMasterTM 2D Elite 5.0)分析，获得每个蛋白点的分子量(Mr)、等电点(pI)及相对含量。

差异表达点的质谱鉴定

加大双向电泳中的蛋白上样量(1 mg)，用考马斯亮蓝染色方法进行染色，找到对应的差异点，切出蛋白点后进行脱色、胶内胰酶酶切和肽段提取[5]，然后用MALDITOF/MS进行肽质量指纹谱(PMF)分析。检索结果的可靠性用肽段匹配率、得分值(score)和匹配肽段在对应蛋白内的序列覆盖率进行评价。

统计学分析

用NewmanKeuls方法检验差异蛋白点相对含量的差别是否有统计学意义。

结 果

样本的2DE图谱的分析

本研究小鼠的血清，是将20只小鼠的血清混合，基本可以忽略个体差异。经ImageMaster 2D Elite 5.0软件及手工分析，每块2DE胶可分离近800个蛋白点左右。每组样本都经过3次以上的重复试验，同一份标本平行电泳的匹配率在95%以上，并且各蛋白点的强度变化无显著性差异，说明本实验条件具有很高的稳定性和重复性。差异表达点标示如图1，假照射组与照射组不同时间点差异表达点在2DE图谱上局部放大图如图2。通过对照射组与假照射组血清双向电泳图谱比较发现，在照射组新出现的蛋白点有4个，表达上调的蛋白点有13个，表达下调的蛋白点有6个，消失的蛋白点有3个。不同时间的差异表达点详细列于表1，每个差异表达点的等电点和分子量列表见表2，某些差异表达点在不同时间点表达量呈现动态的变化，图3 为差异蛋白点随时间变化的半定量曲线，%Vol代表蛋白点的相对体积，%Vol=(Vol/∑ns=1vols)×100， Vols是在包含n个蛋白点的一张凝胶中蛋白点S的体积。%Vol把蛋白质上样和染色引起的变化考虑进去,当%Vol比较超过两倍以上认为有统计学意义。如图3所示，11、12号点在24、48、72小时与假照组相比表达均上调，但在48小时表达上调最明显，在72小时蛋白表达量逐渐降低。5号点在照射组48小时表达量最少。

差异表达点的质谱鉴定

鉴定结果表明，大多数蛋白点的出峰情况较好。本研究蛋白点质谱鉴定的详细列表见表3。图4为MALDITOFMS对5号点质谱分析结果。一些蛋白在2DE上的位置与理论PI和Mr不符，或在2D胶上表现出不同的蛋白点鉴定后为同一蛋白质，这与蛋白质的翻译后修饰有关，如蛋白酶降解、糖基化和磷酸化，目前鉴定出6种差异蛋白质，其中低剂量照射后新出现Ttr protein，一种未命名的蛋白消失，

讨 论

目前人们对低剂量辐射的作用机制的研究多集中在对个别或少数蛋白质的作用进行探讨，而低剂量辐射对机体的生物效应表现在多个系统和多个层面，有必要用更高通量的方法全面地分析其发生机制。因此用蛋白质组学方法对低剂量照射组及假照射组的血清蛋白质表达差异进行分析，从细胞整体水平上动态地探讨低剂量辐射对造血系统的作用机制，有利于发现与低剂量辐射的作用机制有关的关键蛋白质，为低剂量辐射作用机制的研究开拓的一个新的研究方法。

通过对照射组与假照射组血清双向电泳图谱比较发现，在照射组新出现的蛋白点有4个，表达上调的蛋白点有13个，表达下调的蛋白点有6个，消失的蛋白点有3个。某些蛋白质点的表达在不同时间呈现动态的变化(如11、12、5号点)，这与我们课题组前期工作的结果[6]相一致，低剂量辐射对造血系统的影响在照射后24小时开始出现，在48小时作用最强，在72小时后作用逐渐消失。

本研究发现低剂量辐射后血清中维生素D结合蛋白表达上调，维生素D结合蛋白是核受体超家族的成员[7]，核受体与启动子和增强子上的激素应答元件及其它DNA 序列特异性激活因子结合，从而激活或阻遏靶基因的转录，特异性调控发育、生殖、代谢相关基因的表达，低剂量辐射后血清中维生素D结合蛋白的表达增加，从而影响了信号的传导、基因的表达，可能产生某些保护性蛋白，而发生生物学效应。此外，低剂量辐射后血清中雌激素受体表达减少，有研究表明，前列腺癌激素治疗中常伴有良性但疼痛的乳腺增生，低剂量辐射可以减少或减轻这种副作用的发生[8]，男性乳腺发育与雌激素有密切的关系[9]，低剂量辐射可能是通过减少雌激素受体的表达来影响雌激素的作用从而产生这一生物学效应。另外，雌激素除调节人体生长发育和生殖外 ，在心血管、肿瘤、骨代谢等方面还具有广泛的生物学效应[10]。 雌激素受体也属于核受体超家族的成员[7]，它能与DNA 应答元件(DNAresponsive element) 结合的配体激活转录调控因子，最终通过影响转录起始复合物的组装和活性作用来调控靶基因转录。这些可能是低剂量辐射产生多种生物学效应的机制之一。其它差异蛋白的功能涉及细胞代谢、细胞形态维持和信号传导等有待于进一步探讨。

本课题组以往对低剂量辐射引起生物学效应的研究[11,12]也反映了细胞对低剂量辐射反应过程的多样性，它覆盖了细胞周期、信号传导、细胞骨架、代谢、应激反应等重要的细胞生物学过程中的多种蛋白质表达的变化。本研究通过蛋白质组学方法对低剂量辐射后血清蛋白质表达差异进行分析，表明低剂量辐射使细胞某些蛋白表达上调或下调分泌入血清或者直接使血液有形成分的蛋白发生变化，通过这些蛋白质的变化影响各系统功能的改变，产生兴奋效应和适应效应。这为低剂量辐射作用机制的研究提供了一种新的有效的研究手段，从整体水平动态地探讨低剂量辐射的作用机制，进而为低剂量辐射的临床应用提供实验依据和理论基础。

【参考文献】

1傅海清，鞠桂芝等.电离辐射对小鼠胸腺细胞和脾细胞P53基因mRNA和蛋白表达的影响. 辐射防护，2001，Vol21，No.2，89-92

2Liu SZ, Li XK. Induction of proteins in lymphocytes by in vitro and in vivo irradiation with low dose Xand gammarays. ISBEUES. Chang chun， 1993：71-72

3孟庆勇，陈沙力，刘树铮等.低剂量辐射诱导小鼠脾细胞蛋白表达及生物活性.中华放射医学与防护杂志，2000;4：228-231

4张群业，黄秋花，沈树红等.人APL细胞株NB4不同二维电泳条件对电泳结果的影响. 中国实验血液学杂志, 2004; 12: 401-405

5 Iversen LF, Kastrup JS, Bjorn SE, et al. Structure and function of the Nlinked glycans of HBP/CAP37/azurocidin: crystal structure determination and biological characterization of nonglycosylated HBP. Protein Sci, 1999： 8:2019-2026

6王冠军，谭业辉，张福明等，低剂量辐射对造血系统兴奋效应的研究. 中华血液学杂志，2001; 21，232-234

7汪保和.核受体超家族介导基因调控的分子机制.生理科学进展, 2003; 34:369-372

8Dicker AP.The safety and tolerability of lowdose irradiation for the management of gynaecomastia caused by antiandrogen monotherapy. Lancet Oncol, 2003; 4:30-36

9高坤,孙伟. 雌激素与肾脏疾病的研究进展.中国中西医结合肾病杂志,2004; 5: 738-741

10刘鹏，侨新民，张嘉庆等. 男性乳腺发育与相关激素及雌孕激素受体之间关系的临床研究. 中华普通外科杂志, 2000; 15: 951-961

11Wang GJ, Cai L. Induction of cell proliferation hormesis and cell survival adaptive response in mouse hematopoietic cells by whole body low dose radiation. Toxicol Sci, 2000; 53: 369-376

12Li W, Wang G, Cui J, et al. Lowdose radiation (LDR) induces hematopoietic hormesis: LDRinduced mobilization of hematopoie tic progenitor cells into peripheral blood circulation. Exp Hematol, 2004;32:1088-1096