肺炎链球菌毒力因子研究新进展

　　肺炎链球菌(Spn)是临床重要的病原菌，除可引起鼻窦炎和中耳炎外，也是引起肺炎、菌血症和脑膜炎的首要病原菌。此外Spn引起的感染常导致严重后遗症，如Spn引起的化脓性脑膜炎后遗症，包括听力丧失、局灶性神经功能缺损和认知功能障碍fn0随着基因组学和蛋白组学技术的发展，人们对Spn致病过程中的毒力因子有了更多认识。本文就Spn毒力因子的最新研究作一综述。　　一、荚膜多糖　　荚膜多糖是Spn重要的毒力因子，由荚膜基因(cps)编码圈。cps功能上分为4部分:CapsA,CapsB,CapsC和CapsDoCapsA作为调控因子，调控cp、的转录，但对毒力影响不大。CapsB是一种磷酸化酪氨酸蛋白磷酸化酶，作用于CapsD，使其去磷酸化来开始cp、的合成。新的研究证实通过抑制CapsB实现荚膜合成抑制，进而影响Sp。的毒力[]3]oCapsC和CapsD相互作用，限制荚膜多糖进一步合成，并将合成的荚膜多糖运送至各细胞壁，便于荚膜多糖与细胞壁的连接。实验研究发现，cps与Spn的定植有关，它能够阻止单核细胞对Spn的吞噬作用，并可通过抑制凋亡的方式下调机体免疫反应。通过基因变异技术研究发现，cp、基因变异的鼠模型中荚膜勃附于机体细胞壁是菌体在肺中生存和进人并侵人血液的重要条件.　　二、菌毛　　菌毛在Spn豁附过程中起重要作用。基因组学研究表明rrgA-C,srtB-D对菌毛的表达和功能有重要作用。动物模型实验中菌毛阳性株茹附性强于阴性株。免疫学实验中重组的菌毛亚单位在致命性Spn感染中有一定预防作用[9]。基因组学的统计研究还表明菌毛在菌株青霉素耐药中有一定作用。但是菌毛决定基因在呼吸道定植菌和菌血症中表达率并没有差别，说明菌毛并不是重要的毒力决定因子，其菌体定植、侵袭、炎症前反应过程中的具体作用还有待证实。　　三、蛋白及蛋白酶　　1.Spn的表面蛋白　　(1)胆碱结合蛋白　　Spn表面蛋白A(PspA)、胆碱结合蛋白A(CbpA)和细胞壁水解酶(LytA,B,C)是Spn的胆碱结合蛋白。这些蛋白有非常相似的胆碱结合区(CBDs)，可通过与脂磷壁酸和磷壁酸的磷酸胆碱(PCho)结合实现与细胞壁的连接，在Spn致病过程起一定作用。　　PspA是Spn的重要毒力因子，可与铁转运蛋白一乳铁蛋白结合，使有抑菌或杀菌效果的乳铁蛋白失去铁成为脱铁乳铁蛋白。鼠菌血症模型中，PspA缺失的Spn与野生型Spn相比毒力明显下降，PspA作用减弱对模型起到有效的防护作用，而且多克隆或单克隆抗PspA2Ab被动免疫或PspA的N端片断或PspA复合物主动免疫的小鼠均能免受感染0Ps醉还可通过经典途径抑制人补体C3的激活，限制由补体介导的调理作用，已证实这一抑制作用可有效降低Spn被吞噬的可能，而且可引起炎性因子表达增多，激活T细胞。但是有研究表明PspA的毒力作用与菌株的血清型和荚膜多糖有关「14].Spn表面蛋白C或Spn特异性表面蛋白A(Cb-pA，某些菌称为PspC或SpsA)，可与人多聚免疫球蛋白受体(pIgR)特异性结合，介导菌体穿越呼吸道的豁膜上皮细胞进人内部组织，通过与宿主细胞上的糖肤、唾液酸残基等的结合实现感染。CbpA的表达是菌体进人下呼吸道、脑脊液等必需的物质。CbpA缺失表型株勃附的活性明显下降，实验鼠模型中Spn的定植量和穿过上皮进人血液、脑脊液的量明显下降。CbpA可与补体C3和H因子结合，同时还可与人分泌型免疫球蛋白A(sIgA)以种属特异性方式结合，促进其与勃液上皮细胞的勃附和穿透。有学者发现，H因子除发挥补体的作用外，还可作为中性粒细胞和血小板的勃附配体〔16]。研究发现实验动物模型经抗CbpA抗体、抗H因子抗体作用后，黍占附率明显下降，H因子的存在可加强菌体的勃附，但是具体的戮附机制还有待研究.　　(2)其他表面蛋白　　Spn勃附和毒力因子A(PavA)是细菌外膜表面的一种纤维连接蛋白，被证实是肠球菌重要的毒力因子。PavA0缺失株与野生型Spn小鼠肺炎模型中，缺失株组小鼠存活时间明显延长，缺失株C57BL/6小鼠脑膜炎模型存活率升高〔19]。此外，产PavA株使T细胞的寿命明显延长，PavA重组蛋白可使巨噬细胞对Spn的吞噬明显减弱。　　纤维蛋白溶酶和纤维连接蛋白结合蛋白A(Pf-bA)，位于Spn菌体表面。pfbA基因敲除株体外细胞实验中，缺失株与野生型相比赫附和人侵肺和咽上皮细胞发生率降低，外周血中缺失株抗吞噬性降低[fzo]aPEA有纤维蛋白结合活性，该蛋白的抗吞噬细胞活性可能与纤维蛋白有关，也可能与Fn胶原复合体有关，但具体的机制还不清楚。　　Spn表面茹附蛋白A(PsaA)是一种属于ABC型的转运脂蛋白。PsaA的改变可影响Spn在呼吸道的豁附，是重要的毒力因子，PsaA抗体可减少上皮细胞的吸附。Anderton等指出钙戮蛋白E(E-cad-herin)可作为受体与PsaA相连。E-cadherin抗体可完全抑制体外细胞实验中PsaA的勃附，鼠模型实验中PsaA突变株与野生型相比，毒力减弱，检测各种毒力因子的mRNA水平证实PsaA是Spn的重要毒力因子opsaA还可刺激B细胞产生特异的IgA,IgG和IgM抗体，可激活111细胞，使炎性因子分泌曾加。　　2.热休克蛋白　　高温蛋白A又称丝氨酸蛋白酶A(HtrA)，是一种热休克诱导产生的丝氨酸蛋白酶，见于多种微生物，与多种阴性菌的毒力有关oHtrA是Sp。的毒力因子。缺失株和野生型动物实验中，HtrA缺失株毒力明显降低，发生毒力变异的菌株在肺中不能生存，会很快被清除，炎性因子IL-6和TNF-。明显减少。　　Atp依赖性酪蛋白水解酶(Clp)属HSP100/Clp家族，亦是一种丝氨酸蛋白酶。气管内感染模型研究表明C1pC缺失可使感染程度明显减弱，可能与该酶影响胆碱结合蛋白和Spn溶素等毒力因子的表达有关，此外C1pC对Spn在肺和血液中繁殖有重要意义(26}。目前的研究只说明Clp可作为一种毒力因子，但是具体的毒力作用有待研究。　　3.碳水化合物相关酶及调节物　　为侵袭需要，Spn有很多碳水化合物分解方式并因此进行豁附，糖昔酶即其中一种方式。Spn(3半乳糖昔酶A(BgaA)是一种半乳糖昔酶，位于菌体表面，以唾液酸依赖的方式存在，主要作用是糖复合物的去糖基化。体外实验证实BgaA可作为Spn的豁附分子，茹附作用与它的酶活性无关[2]。通过基因测序、体外基因表达、基因敲除等技术发现BgaC也是一种半乳糖昔酶，是Spn。毒力因子.　　Spn至少含3种神经氨酸酶(Nan)，最主要的为Naris、和NanB，可分解细胞表面或体液中的多糖、糖蛋白、低聚糖上的唾液酸残基，暴露宿主细胞表面的Spn豁附受体，促进细菌的豁附。体外细胞实验发现，NanA缺失变异株载附到上皮细胞量减少，变异株补充nanA后豁附量增加，证明NanA通过受体介导豁附过程在生物膜形成过程发挥重要作用「29].NanB表达量远低于NanA，也能促生物膜生成，而且NanB的存在和作用有组织特异性。　　最近研究发现各型Spn基因组内广泛存在一个相同区域，可表达与碳水化合物分解有关的纤维二糖磷酸转移酶、硫酸醋酶等[30]。经过生物信息学比对分析发现该区域在Spn毒力方面有作用，该区域删除或替换后引起的肺炎/菌血症实验鼠模型病情减弱。该区域的不同位置可分别引起不同部位尤其是肺部不同程度致病，而且有些区域与载附有关〔31]。除上述基因区外，调控类似上述区域表达的物质在菌体致病过程中也发挥一定作用。　　代谢调控蛋白A(CcpA)是碳代谢压(CCR)的主要调控因子。研究发现，Spn典型毒力株D39的Cc-pA在鼠菌血症模型中具重要的毒力作用32，该基因缺失可使Spn毒力明显减弱，鼻咽道的菌体定植减少。其他菌属菌种CcpA可作为毒力因子，可能与该基因下调的毒力蛋白和豁附分子有关.　　4.其他蛋白类　　Spn溶血素(Ply)是一种胞内蛋白溶血素，是革兰阳性菌体中的一种胆固醇依赖性的细胞溶素。Plv的释放依赖降解细胞壁的lytA。除促细胞溶解作用外，研究发现疾病发生早期Ply可与支气管单层上皮细胞相互作用，破坏细胞间致密连接，破坏单层细胞的完整性，但具体作用机制尚不清楚。在炎症反应过程中Plv可识别结合刺激中性粒细胞和单核细胞引起炎性因子释放.Spn类真核细胞蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(stkP>调控菌体生长同时在肺部感染和血液侵袭方面发挥毒力作用。与StkP共转录的磷酸酶(PhpP)经基因敲除技术和动物实验发现其在Spn豁附和生物膜形成过程发挥重要作用。此外研究发现StkP与PhpP共同介导Cb沁表达的调控.　　四、其他毒力因子　　参与氧化应激的超氧化歧化酶、核酸内切酶、基质降解酶等也是Spn重要的毒力因子[37]。研究表明，在原核和真核细胞基因调控方面有重要作用的sRNAs也对Spn的致病起重要毒力作用[38]。此外，动物Spn模型实验中通过菌体刺激前后菌体细胞内基因表达情况的变化，发现aLiA，mczLX和声uA基因〔39-40〕在Spn肺炎发生过程有重要作用，但是具体的作用机制还有待研究。　　五、结语　　Spn引起的疾病与许多毒力因子有关。荚膜多糖、Ply,Spn表面结合蛋白等是人们熟知的毒力因子，但是人们对它们毒力作用的了解随着新技术的发展在不断更新。此外，新的毒力影响因子如sR-NAs,aLiA,malX和娜uA基因等也不断被发现。毒力因子研究将继续为Spn感染疾病的预防和治疗提供新的靶点，从而有效地治疗这类疾病。　　参考文献　　俞桑浩,王辉,沈叙庄. 肺炎链球菌临床检验的共识[J].中华检验医学杂志,2012,(12):1066-1072.doi:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.12.003.　　Roth A,Reichmann P,Hakenbeck R. 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