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《微生物学与免疫学》

长期甲基丙烯酸羟乙酯刺激下对免疫系统的影响研究

发表时间:2015-04-21  浏览次数:1739次

现代牙科医学中,树脂改良型玻璃离子水泥以及粘接剂被广泛用于口腔牙齿修复。在这些材料中普遍存在的一个成分就是甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)[1-2]。一般固化修复体中的少量未聚合HEMA单体会在治愈后的数月内慢慢渗漏出来接触牙髓以及口腔黏膜[3-4]。2-HEMA作为一种树脂材料在口腔诊所中广泛应用也会存在于其空气中[5]。有研究显示HEMA可以影响免疫系统的很多功能[6-7]。例如,HEMA单体修饰的自体蛋白可以被免疫系统确认为抗原激发机体产生抗HEMA的IgG和自身抗体[8]。此外,小鼠皮下注射HEMA能够导致脾细胞产生白细胞介素-6和白细胞介素-10减少。并且在许多体外实验研究中发现HEMA具有细胞毒性作用[9-12],在这些试验中HEMA持续刺激长达6周。而本研究目的则是尝试模拟个体长期接触HEMA的情况并进一步验证体内长时间接触HEMA是否会影响机体的免疫系统功能。现报告如下。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验试剂与抗体: 甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、卵清蛋白(OVA)、超亲和碱性磷酸酶、对硝基苯基磷酸酯以及Tween-20购自美国Sigma公司;淋巴细胞分离液购自瑞典的GE公司;胎牛血清、DMEM培养基购自美国GIBCOBRL公司;生物素化的山羊抗小鼠IgG、IgA、Ig抗体购自美国BD公司。

1.2 实验方法和步骤1.2.1 实验动物与HEMA的预处理:雄性6~7周龄的BA LB/c小鼠(吉林大学动物实验中心购买)。HEMA使用前需要通过含有聚苯乙烯-二乙烯基苯珠的柱子过滤掉里面含有的抑制剂氢醌单甲基醚。1.2.2 预培养和渗透泵的植入:Alzet微型渗透泵(购自美国CA公司)分别填充0.9%NaCl、去除抑制剂的8.2 M(HEMA未稀释)以及183 μM( HEMA原液溶于0.9%NaCl)的HEMA。小鼠携带装有8.2 M的泵每小时HEMA的接触量是161 μg ,而携带装有183 μM的泵每小时HEMA的接触量是3.6 ng,与此同时对照组是每小时1.36 μg的NaCl接触量。在无菌的条件下在小鼠的后背做一个切口植入微渗透泵后缝合,在整个实验过程中记录小鼠的体重,在植入微渗透泵40后处死,去小鼠脾脏和血清。1.2.3 动物免疫:在微渗透泵植入19天后,从鼠尾静脉注射卵清蛋白进行免疫(卵清蛋白溶解于100 mM碳酸氢钠缓冲液)。为加强免疫的效果,于微渗透泵植入34天后再次注射卵清蛋白。前后两次总共注射50 μl缓冲液其中含有50 μg卵清蛋白。1.2.4 脾细胞的分离和上清的检测:每一组8只小鼠,微渗透泵植入40天后分别取脾脏分离获得脾细胞,培养于DMEM,含10%FBS,牛垂体提取物(PEX)20 μg/ml,肝素钠10 U/ml,置5% CO2、95%空气培养箱37℃培养。按ELISA (购自美国BD公司)试剂盒说明书检测脾细胞上清液中的IL-2和TNF-alpha。1.2.5 〖JP2〗血清中抗卵清蛋白的IgA、IgM、IgG 检测:采用特异的ELISA(购自美国BD公司)试剂盒,按照说明书步骤进行操作。

1.3统计学分析:各分组所得计量数据采用均数±标准误(x〖TX-*3〗±s)表示,用SPSS 17.0软件处理数据,两组间均数比较用t检验,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 低浓度与高浓度HEMA以及对照组0.9%NaCl对小鼠体重的影响:在植入微渗透泵的40天161 μg/h HEMA 组(实验结束时小鼠增加的体重平均数是4.5,标准差是0.7,一共8只)相比较于对照组1.35 μg/h NaCl (实验结束时小鼠增加的体重平均数是6.4,标准差是0.9,一共8只)体重的增加时明显减少的(图1A 、C)。另外,3.6 ng/h HEMA 组相比较于对照组在初期体重增加是明显减少的,但是在实验的后期两组小鼠在体重增加上没有明显区别(图1B、C)。 体内长期接触2-甲基丙烯酸羟乙基酯对体重的影响,记录了小鼠植入微渗透泵40天的体重注:A.161 μg /h HEMA 组;B.3.6 ng /h HEMA 组;C.1.35 μg /h NaCl 组。图表反应的是植入微渗透泵后相比较于植入前的体重增加的平均数和标准差,P <0.05 ,都与对照组相比较。三组分别是8只小鼠。

2.1低浓度与高浓度HEMA以及对照组0.9%NaCl对脾细胞相关细胞因子生成以及血清中抗卵清蛋白IgA、IgG、IgM的影响:无论是161 μg/h HEMA组还是3.6 ng/h HEMA组的脾细胞在长期接触HEMA后取出培养后的上清中的白细胞介素-2均少于对照组(图2A)。此外,3.6 ng/h HEMA组相比较于161 μg/h HEMA组脾细胞上清中的白细胞介素-2则明显减少。但是,我们在实验中没有发现脾细胞TNF-α的分泌在三组之间有明显的差别。与此同时,在试验中发现3.6 ng/h HEMA组小鼠血清中的抗卵清蛋白IgA明显低于对照组(图2B),而抗卵清蛋白IgG、IgM在三组之间差异无统计学意义。体内长期接触2-甲基丙烯酸羟乙基酯对脾细胞白细胞介素-2生成以及血清中抗卵清蛋白IgA的影响〖ZK)〗注:A.ELISA检测白细胞介素-2,三组之间两两比较;B.ELISA检测抗卵清蛋白IgA,3. 6 ng/h HEMA组与对照组比较

3讨论

在我们的研究中,将注有不同浓度的甲基丙烯酸羟乙基酯移植于小鼠的皮下缓慢释放从而尽可能的模拟个体在相当长期一段时间里接触到甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)的情况。而各种含有HEMA的复合材料以及粘接剂的生物相容性都已经有所研究[13-15]。然而在那些研究中使用的都是HEMA的商业成品而不是HEMA的纯化学单体。所以,本研究中首次模拟个体长时间接触HEMA纯化学单体后对免疫系统的影响。研究中发现,长时间接触HEMA会影响小鼠体重的增长。也就是说,接触微量HEMA也会随着时间的推移进而影响动物的一般健康状况。而造成如此损伤的根本原因可能是HEMA引起的炎症,而炎症又进一步影响动物的食物摄取和新陈代谢。并且已经有研究发现机体在接触 HEMA后会产生一定的抗炎反应[16]。但是在本研究中植入微渗透泵40天后的组织活检中未发现任何明显的炎性反应(试验结果未提供)。本试验中进一步观察到长期接触无论是高浓度还是低浓度的HEMA的小鼠与对照组相比,取脾脏后培养脾细胞后的上清中的IL-2的生成都显著减少。而与此同时,低浓度HEMA组的 IL-2的生成又明显低于高浓度HEMA组其原因则可能是微渗透的特性所导致的。通过检查40天后的微渗透泵中的剩余液体量发现高浓度组的微渗透泵中的液体已经释放完毕而低浓度组和 NaCl溶液组的微渗透泵中尚剩余部分液体,说明高浓度组的微渗透泵液体释放速度是快于其他两组的。所以,实际上40天内高浓度HEMA组小鼠体内HEMA单体的浓度在后期是低于低浓度组的,这就解释了为什么表面上看上去更高浓度的HEMA反而抑制IL-2的效果却弱于低浓度的 HEMA。而三组之间TNF-α的生成没有区别则表明IL-2的减少是HEMA刺激后脾细胞的特异选择性作用而非一般的普遍作用。  同时通过注射溶于碳酸氢钠缓冲液的卵清蛋白来观察体内长期接触HEMA对机体免疫系统造成的影响。研究中发现在接触HEMA组与对照组动物之间的抗卵清蛋白IgG和IgM的活性没有显著的差别。其原因可能是从微渗透泵中释放出来的HEMA纯单体在体内很快与蛋白结合后而被清除,从而导致HEMA由于浓度太低无法提高生成抗卵清蛋白Ig的量。然而,抗卵清蛋白 IgA的活性却在小鼠长期接触低浓度的HEMA后显著降低。造成这个结果的原因可能是由于HEM A刺激T细胞后产生的影响。进而损伤了免疫后B淋巴细胞转变生成IgA,与此同时B淋巴细胞转变生成IgG与IgM却是发生在免疫之前,所以没有显著的变化。综上所述,小鼠体内长期接触微量HEMA会影响一般身体状况并且影响到T细胞和B细胞的功能,表明机体较长一段时间接触微量HEMA是会对正常免疫系统功能产生一定影响的。

4参考文献

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[收稿日期:2013-11-26编校:潘宏竹]

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