噬菌体裂解酶作为抗菌药物的研究进展

噬菌体裂解酶( bacteriophage endolysins, lytic eu- zymes,lysins,muralvtic/mureolytic enzymes)是由双链 DNA噬菌体编码、依靠宿主菌合成的酶，产生于溶菌周期中的生物合成晚期[1]。大多数噬菌体依靠裂解酶水解细菌细胞壁中的肤聚糖从而释放子代噬菌体[2]。 人们早已发现噬菌体裂解酶裂解细菌的特性， 1958年Jacob等[3]将其命名为。ndolvsin, Freimer 等[4]随即于1959年报道了纯化的裂解酶具有杀菌能力。尽管此后仍有噬菌体用于抗菌的研究，但由于当时抗生索疗效显著，且大多数噬菌体的实验不够成熟，对噬菌体抗菌的探索一度被搁置，直到2001 年Nelson等[5]才证实纯化的重组裂解酶能作为局部抗菌物质。如今传统抗菌药物的问题日益突出，细菌对抗生素的耐药性急剧增加，新型抗生素短缺，制药产业研发新型抗生素的投人减少[6，7]当抗厂卜素对泛耐药的“超级细菌”束手无策时，人们开始将目光重新投向噬菌体及其产生的裂解酶。

1裂解酶的结构和溶菌机制

大多数噬菌体裂解酶具有“双结构域结构”的特点:N一端结构域具有催化活性，能够特异地切断肤聚糖中的化学键,C一端结构域可以与宿主细菌细胞壁上的特异性底物结合[8,9]。还有一些噬菌体具有其他结构的裂解酶。一此裂解酶(如大多数分支杆菌噬菌体裂解酶)含有多个不同的催化结构域和一个结合结构域[10,11]。金黄色葡萄球菌噬菌体vB SauS-phiIPLA88 ( phiIPLA88)编码的裂解酶HydH5拥 有两个催化结构域，而不含结合结构域[12]。少数革兰阴性菌噬菌体裂解酶N端为结合结构域，而C端为催化结构域[13,14]. 根据裂解酶催化结构域的作用位点，可粗略地将其分为胞壁酸酶(muramidases/lysezyme，作用于胞壁上聚糖骨架中的b-1,4-糖普键)、肽链内切酶 (eudopeptidases，作用于多肤链)或酞胺酶(amidases , 水解聚糖骨架和多肤链之间的酞胺键[15](图1) 分支杆菌噬菌体裂解酶Lysiu B还有另一种裂解活性，能水解分枝菌酸和肤聚糖一阿拉伯半乳聚糖复合物间化学键[16,17].

裂解酶从细菌内部裂解细菌的方式称为“自内裂解”。当然噬菌体裂解酶在细菌外也能发挥快速、高效的溶菌作用。将某些裂解酶加至对其敏感的细菌中，在缺少噬菌体的情况下一也能引起细菌裂解，即 “自外裂解”( lysis from without)[18]. 革兰阴性菌的外膜能够抵御裂解酶直接与细胞壁上的肚聚糖接触，从而影响裂解酶的作用[19]，但仍有部分噬菌体能通过各种机制发挥裂菌功能，如T4 溶菌酶(T4噬菌体的裂解酶)和OBPgI>279等[13,20]。此外，有研究[21]表明，虽然外膜使革兰阴性菌噬菌体裂解酶与其结合位点亲和力远低于革兰阳性菌噬菌体裂解酶，但某些革兰阴性菌噬菌体裂解酶的亲和力仍保持较高水平，能够发挥一定的裂解作用，如铜 绿假单胞菌噬菌体裂解酶KZ 144等。 因此，裂解酶的活性和结构特点显小了其良好的抗菌作用，也使其在成为新型抗菌药物方面拥有广阔的前景。

2 噬菌体裂解酶作为抗菌药物的优势

2. 1相对特异性 裂解酶具有较高的特异性。一般来说，葡萄球菌噬菌体产生的酶只能杀灭特定的葡萄球菌[5]，肺炎链球菌噬菌体产生的酶只能杀灭特定的肺炎链球菌[24]，因此，裂解酶儿乎不会影响正常菌群但部分噬菌体裂解酶一也具有一定的广谱性:瑞士乳杆菌噬菌体o0303的裂解酶Mur-LH、无乳链球菌噬菌体 B30的裂解酶和产气芙膜梭菌噬菌体o3626的裂解酶P1y3626均可裂解多种细菌[25 -27]几粪肠球菌噬菌体o 1的裂解酶P1yV12不仅能裂解粪肠球菌和乳酸肠球菌，还可以裂解化脓链球菌、B群,C群链球菌和金黄色葡萄球菌等革兰阳性细菌，其为目前发现的裂解谱最广泛的裂解酶之一[28]。由此可见，与抗生素相比，裂解酶具有更好的特异性，而裂解谱比噬菌体更广泛 。

2.2杀菌能力 高效性是噬菌体裂解酶的特点之一。体外实验中裂解酶可以在与细菌接触后数秒内迅速使细菌细胞破裂Sehuch等[29]，将2个单位(2ug)的炭疽芽胞杆菌y噬菌体裂解酶P1vG加人1.0x104耐链霉素的蜡样芽饱杆菌RSVF1中，10s内就能使细菌裂解;将2个单位的P1vG加人1 mL约108)对数生长期的RSVF1 中 ,20 s就使细菌数降低l7 000倍，并在 2 min时杀灭几乎所有细菌。 大量的实验证明，噬菌体裂解酶在各种感染性疾病动物模型中显示了良好的治疗效果。Rachel 等[30]通过小鼠体内实验证实，针对金黄色葡萄球菌的重组裂解酶能高效安全地清除鼻腔的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，而且能通过腹腔给药防止腹腔接种过耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的小鼠因感染死亡Grandgirard等[31]的肺炎链球菌性脑膜炎ristar 大鼠实验也显示，脑池内或腹腔内给予肺炎链球菌噬菌体裂解酶Cpl-1，能够使脑脊液中肺炎链球菌大幅迅速减少。在肺炎链球菌lVB4引起的心内膜炎鼠模型中，大剂量静脉输人Cpl-1能使血液中的细菌快速减少[32]。在金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的老鼠皮肤模型仁还发现，针对葡萄球菌的嵌合裂解酶C1yS抑菌效果优于莫匹罗星[33]. 噬菌体裂解酶还能在钻膜表面表现出良好的特异性杀菌效果N elson等使用多种钻膜菌落的动物模型证实裂解酶在私膜表面能有效杀灭病原菌。在A群链球菌的口咬菌落模型中，在使用500个单位的链球菌噬菌体C1的裂解酶2h后，未检出链球菌;在肺炎链球菌的鼻腔模型中，使用1 400个单位的肺炎链球菌噬菌体裂解酶Pal 5 h后，也未检出肺炎链球菌;在日组链球菌的阴道模型和口咽模型中使用B群链球菌裂解酶PIyGBS 2 h和4h后，也得到了相似的结果。 此外，部分噬菌体裂解酶对生物被膜中的细菌也具有杀菌作用生物被膜是由微生物细胞及其分泌物连接于各类表面而形成，抗菌药物较难杀灭埋于生物被膜基质内的细菌35然Ifill研究发现，噬菌体裂解酶能在此发挥作用:Sass等36发现金黄色葡萄球菌噬菌体cp 11的裂解酶能有效水解金黄色葡萄球菌NCTC8325的生物被膜,oll余黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶SAL-2一也同样具有清除生物被膜的能力下 .

2.3协同作用 几种裂解酶或裂解晦与抗生素联合使用时能产生协同作用，提高杀菌效果二研究只发现将具有不同作用位点的金黄色葡萄球菌噬菌体phiIPLa88的裂解酶H州I-I}和L}}sHS混合使用能产生更好的体外抗葡萄球菌的作用。Jado等研究发现，2.5 p-裂解酶HYDH5和LYSH5混合使用时的杀菌作用强于单用5 ug Cpl-1或Pal还有研究[40]证实，裂解酶Lysk和葡萄球菌溶素联合应用时也会展现协同作用 此外，肺炎链球菌裂解酶Cpl-1与抗牛索联合使用也具有相似的协同作用Cpl-1与低于最小抑菌浓度的庆大霉索联合使用能更好地杀灭肺炎链球菌，Cpl-1也能与青霉素发挥协同作用杀灭青霉素耐药菌。因此，合理联合使用酶类与抗生素能更好地控制特定抗生素耐药菌。

2. 4不易产生耐药性 细菌对噬菌体产生耐受远慢于对普通抗生素产生耐药性[42]。研究发现，琼脂或液体培养基中的肺炎链球菌经反复低浓度裂解酶作用后，未发现耐药性菌株产生。耐链霉素的蜡样芽饱杆菌RSVFl经低浓度或高浓度裂解酶P1vG反复作用，也米自发产生耐药性。虽然细菌处于稳定期时，可能通过改变细胞壁结构如增加交联链、氨基糖去乙酸化、增加细胞壁相关蛋白和多糖，从而降低对裂解酶的敏感度[24,25]，但整体而言.细菌还是不易对裂解酶产生耐受.

2.5安全性

至今，大量研究[30 -33]证明，在动物皮肤、鼻腔豁膜、腹腔、静脉、脑池和脑脊液等处应用噬菌体裂解酶后，并未发现不良反应每天刘一小鼠私膜和皮肤使用针对A群链球菌的裂解酶，连续7d一也未发现任何组织的病理学异常. 以往研究[44]发现，与裂解酶结构相似的葡萄球菌溶素能够结合并降解富含甘氨酸的弹性蛋白，囚此人们推测裂解酶(尤其是肤链内切酶)一也可能存在对哺乳动物组织的潜在危害。但在全身和局部应用葡萄球菌溶素时，井末发现任何不良反应。 此外，由于裂解酶具有高效的裂菌能力，人们也担心其灭菌时会使细胞壁、细胞膜上的各种促炎物质如内毒素、磷壁酸和肌聚糖释放，导致感染性体克和多器官衰竭，然而至今并未见相关报道[39，48]. 因此，噬菌体裂解酶在体内应用时.还是具有较高的安全性，但也应对其可能存在的危险保持一定的警惕.

3裂解酶的体内清除

裂解酶是蛋白质分子.在应用于孰膜或个身时一，会刺激机体)伏生免疫应答，从而抑制其活性.加快其体内清除速率研究发现，肺炎链球菌噬菌体裂解酶Cpl-1在小鼠体内的半衰期很短，为20. 5 min，这导致1-2次应用Cpl-1不能完全清除小鼠体内的肺炎链球菌，之后感染会再次发生。还有研究显示，对小鼠腹腔反复3次注射裂解酶}'IV-L激活免疫反应，会使其血清中的抗体水平大幅上升. 但部分研究结果表明抗体对裂解酶的影响有限，例如，在体外实验中.兔的高价免疫血清也只是对其活性产生一定限度的抑制;Rachel等[30]将金黄色葡萄球菌噬菌体oM R11的裂解酶MV一L与鼠的免疫血清棍合孵育1 h,也获得了同样的结论。 Loessner等的研究也显示:当针对结合结构域的特异性IgG存在时，李斯特菌裂解酶的结合结构域仍会与细菌细胞壁上的底物结合，这表明裂解酶刘底物的亲和力高于其对抗体的亲和力，虽然这能够解释抗体不能中和噬菌体的结合结构域，但无法解释为何抗体无法中和催化结构域。 因此，免疫反应对裂解酶的影响主要在于加快体内清除。裂解酶在体内还可能被水解酶降解而失活，经肾脏被清除，这都加快了其在体内清除的速度，从而对其临床应用产生较大的阻碍。有一些方法能够减缓裂解酶的体内清除研 究巳显示，间隔适当时间反复给药或持续静脉给药能使裂解酶在体内长时一间保持活性。Resch等发现Cpl-1二聚体的血浆清除速度明显小于Cpl-I单体，实验中，小鼠尾静脉注射30 min后Cpl-1二聚体的血浆浓度是单体的20. 32倍，5h后仍为单体的 7. 76倍，这是因为Cpl-1二聚体的相对分子量超过人类肾小球60 000一65 000的滤过阑值，因此减少了其肾小球滤过率。此外，Cpl-1二聚体的抗菌能力是相同摩尔浓度Cpl-1单体的2倍因此，多聚裂解酶也是一种减缓裂解酶体内清除的方式。此外，Resch 等;,还尝试将Cpl-1与聚乙二醇连接，以减缓其清除速率，但聚乙二醇分子结构影响了裂解酶的活性，虽然实验失败，但这也是一次很有意义的尝试 。

4设计改造裂解酶 蛋白质的结构设计和蛋白质组学的进步无疑推动了裂解酶改造领域的发展，近期出现较多该方面的研究

4.1嵌合酶 一些裂解酶能够通过替换结构域改变其特异性和催化活性。将链球菌噬菌体裂解酶入SA2的肤链内切酶结构域(入SA2酶切位点存在于链球菌和葡萄球菌的肤聚糖上分别与葡萄球菌噬菌体裂解酶 Lysk及葡萄球菌溶索的SH3b结合结构域组成阶:合酶，不但能对金黄色葡萄球菌(包括青霉素耐药株) 产生较高的裂解活性，还保持原来对链球菌的活性。还有研究，金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶HYDH5和葡萄球菌溶素的3种融合蛋白 HYDH5SH31o(HYDH5+SH3b结构域)、CHAPSH3b (半胧氨酸和组氨酸依赖的氨基水解酶/肤酶(CHAP 结构域+SH3h结构域)和HYDH5Lvso(HYDH5+Lvso- staphi司都展现出比HYDH5更高的裂解能力 因此，通过对裂解酶的修饰和改造，不仅能增加裂解酶的裂解活性，还能使其更准确地针对不同的口标致病菌，达到优化裂解酶的目的。

4. 2裂解酶截短 研究发现一些裂解酶在去除C端时，依旧具有溶菌活性，如德氏乳杆菌噬菌体LL--H编码的 Mur,而有些酶C端缺失或部分缺失后活性反而增强。Loessner等发现金黄色葡萄球菌裂解酶Ply187 的全酶活性低，但其N端的1-157氨基酸(aa)具有高活性，而158-227 as和158-628aa却没有活性。Chena 等也发现B群链球菌裂解酶PlyGBS的多种片段丢失的突变型活性增高，如仅保留N端1-141 as和C 端的13个氨基酸，裂解活性为全酶的28倍截去葡萄球菌裂解酶LysK的一些肽链，只剩下CHAP结构域时，其仍保持裂解葡萄球菌(包括MRSA)的活性。艰难梭菌噬菌体裂解酶CD27L被截短，剩下N端结构域CD27L1-179，不但增加了对艰难梭菌的裂解活性，其裂解谱亦有所扩大，而裂解酶的另一半CD27T180-270则没有裂解活性。因此，这又是一种调节裂解酶特异性的方一式;此外，如此截短裂解酶，甚至成为单结构域蛋白，其相对分子质量大大减小，或许能减少免疫应答的发生。

5结语

裂解响能够快速高效地破坏细菌的细胞壁，且尚刁、发现对人体的直接不良作用;其特异性处于抗生索和噬菌体之间;细菌刘一其不易产生耐受性。如今可以通过重组DNA和质粒转化细菌从而大量表达目的裂解酶，使其易于获得，因此其作为新型抗菌药物具有一定的优势。虽然裂解酶存在一些缺点.但理论和实验都支持可以通过基囚工程设计改造裂解酶使其成为人们所寻求的理想抗菌物质。裂解酶在抗菌方面具有较大的开发价值，通过不断地研究有望成为解决耐药菌问题的一种有效方法。

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