重组杆状病毒载体介导钠碘转运体基因在胰岛细胞中表达的研究
发表时间:2014-06-18 浏览次数:1353次
急性T淋巴细胞白血病(T acute lymphoid leuke- mia , T-ALL )是一类恶性淋巴细胞增殖性疾病,其特征为T细胞恶性克隆积聚同时可伴肝脾等组织浸润。超过60%的T-ALL患者体内存在Notchl基因突变,导致Notcl:信号通路过度激活}。Notcl:受体是细胞表面蛋白家族中的一员,它的信号转导失调会导致人类多种疾病和肿瘤的发生23。在人类 T-A LL亚型中鉴定出t(7;9) (q34;q34. 3)染色体的易位[4];,这个染色体易位使Nolchl胞内区域与T细胞受体一日链的启动子/增强区域在膜内侧面相邻,从而激活了T细胞中的Notch信号[5]。研究[6]发现,将截短的人Notch 1胞内功能域(IC N 1 , Notch氨基酸序列:1762-2555)导人小鼠的造血前体细胞中过表达可导致T-_41,L的发生[6]。2007年,Chem等[7]应用T 淋巴细胞特异的Rag2启动驱动人ICNI携绿色荧光),将其注射人斑马鱼胚胎中建立了斑马鱼'I'-ALL 模型、同期研究8,,还显示, N otch信号通路也是肿瘤新生血管主要的调控因素之一。而NotChl信号参与T-ALI发生和肿瘤血管新生的关系仍不清楚。本研究在血管内皮增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的斑马角系(f1i 1- F GFP)中,应用T淋巴细胞特异性Rag2启动子驱动携带红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人源性1CN1(IC N 1-RFP ),建立红绿双荧光示踪的双转基因(Rag2-ICNI-RFP/(1il-FG FP)斑马鱼T-ALI模型,为深人研究Notchl促使T- ALL发生、发展的分子机制以及探究Notchl在T-ALI发病过程中相应血管形成的变化提供研究平台。
1材料与方法
1.1材料 1.1.1实验用鱼野生型AB品系斑马鱼( 1Z'T)和 flit -EGFP标记的转基因品系斑马鱼(下文中简称Flil-EGFP斑马鱼)由上海南方模式生物研究中心斑马鱼实验室提供。饲养温度为28. 5 ℃;光照与黑暗时间为 12 h:12 h。野生型AB品系和Flil-EGFP转基因品系斑马鱼的胚胎用系统水养殖,显微注射后24 h以内的胚胎用郝氏液培养,24 h后改用系统水养殖,7 d 后以草履虫喂养,14 d后喂以丰年虫,2个月后放至循环水系统中用红线虫和丰年虫混合喂养 1.1.2原始质粒及菌株Kag2-IC1}1-EGFP原始质粒由J Chen教授(哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所肿瘤利科)惠赠,pDsRPaI-N1质粒购自Clontech公司。 E. coli菌株DH5a和TOP10为Tiangen公司产品。 1.1.3主要试剂各种限制性内切酶购自NEB公司;'I',-DNA连接酶和反转录聚合酶链反应试剂均购自Promega公司;DNA长片段高保真聚合酶L A Tog 购自TaKaRa公司;Tiangen QuantcDNA第一链合成试剂盒为Tiangen公司产品,引物均由上海博尚生物技术有限公司合成;质粒抽提试剂盒QiagenMaxi- PrepKit购自Qiagen公司;TI}Izol试齐al购自Invitrogen 公司;细胞裂解液购于Fermenta;公司,人源ICN1抗体和斑马鱼内参抗体汗actir,购白美国AOGMA公司,细胞周期检测试剂盒为TIAN GEN公司产品 1.1.4主要仪器体视荧光显微镜(NIKON SMZ- 1500 ) ,显微注射系统(Narishige IM300)和流式细胞仪(BD FAGS ARTA II SORP,美国)等均由南方模式月物研究中心提供
1.2方法
1.2.1构建Rag2-IC N1-RFI”质粒设计Rag2启动子前向PCR引物和ICNl段后向PCR引物,并在引物两端添加酶切位点,采用I'CR方法打一增出Rag2 + ICNI长片段引物序列为上游引物:5'-GT1':ACCT(:G AG C AAA A'CC AATCC'I'.1ATG-3'(下划线部分为xho I酶切位点),下游引物:5 ' -Grl'TAAGCI'TCTTG:} ACGC CTCCGG ATGCG-3'(下划线部分为Hind III酶切位点)PCR程序:94℃预变性5 min;94℃变性30s、 8 . 7 ℃退火1 min ,72℃延伸11 min,共30个循环; 最后7 2 ℃延伸10 min0 PCB产物长度约为9. 2 kb. 跑胶后割胶纯化回收。回收产物和质粒载体 pDsredl-n1均用xho 1和Hind III进行双酶切,并连接转化.克降菌小量抽提质粒后用Xho I和Hind III进行双酶切鉴定,将重组质粒送测序并验证无误二在证明重组质粒构建成功后,将重组质粒大量扩增抽提用于显微注射 1.2.2显微注射及转基因斑马鱼的筛选和建系将重组质粒Rag2-ICN1 -RPLFP用Xh,o I线性化并且经纯化后显微注射到单细胞期的flil-EGFP斑马鱼胚胎中,使重组质粒的终质量浓度达到50一100 ng/UL,每卵注射量约为2 nL。注射后将胚胎培养至1个月左右,在荧光显微镜下将其胸腺处R I'P阳性的鱼挑出,并继续培养成为FO代转基因斑马鱼(嵌合体)。在已性成熟的FO代成鱼之间采取一对一形式交配,产下的胚胎用同样的方法筛选出PFP阳性的F1代转基因斑马鱼。 1.2.3斑马色总RNA.提取及CDNA制备将胚胎或组织在TIiIzol中匀浆后,12000 r/min离心5 min; 去除沉淀,加人大约1/5体积的氯仿,充分混匀后室温放置约15 min;4℃一下12 000*g离心15 min;将水相转移到另一新离心管,加人等体积的异丙醇混匀,室温下放置15 min;4 ℃下12 000 x g离心10 min , 去除L清液、此时可见白色RNA沉淀,加人1 mL 75%乙醇温和振荡,悬浮沉淀;4℃下8 000 x g离心 5 min,去除上清液;室温干燥后用DEPC处理的去离子水溶解沉淀,测定其浓度后使用Tiangen (want cDNA第一链合成试剂盒制备cDNA。反应体系:lx 超纯dNTP ( 2. 5 mmol/ I . ) 2浏,,10 x 1LI' a合物2时·,随机引物(10 N.mol/L) 2 Lz,l,,模板RNA 2 ug, Quant 反转录酶1ug,无RNase双蒸水补足至20 },L,37℃下孵育60 mi门。所得cDNA可直接用作RT-PC1}模版。 1.2.4 RT-PCR检测ICN1 mRNA的表达以W,, fli 1-EGFP , FO , FI代30如f的cDNA为模板,检测转基因ICN1的表达。为避免与斑马鱼源性Notchl基因发生交叉反应,引物序列为特异性针对人源性 ICV1,具体引物序列见表1, RT-PCR反应体系: C.DNA1uL,引物(20 umoL/L) 1 NL,10 x Extaq缓冲液2uL,dN'I'P(2.5 umol/L)4uL,ExToq 0.5ul.去离子水补足体积为20 uL 1.2.5 Western blotting检测ICNI蛋白的表达取斑马鱼组织加人细胞裂解液后匀浆(冰上操作),高速离心后取上清并进行定量。取等量蛋白样品加人 5x土样缓冲液,煮沸10 min,上样进行SDS-PAGE电泳;电泳结束后用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,装模电压100 V,60 min;转移完成后,将PVDF膜用去离子水冲洗,放人5%脱脂奶粉中,室温封闭1h; 加人一抗,4℃孵育过夜。'I'BST洗膜3次,每次 10 min ;加人辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育 I h,TBST清洗膜3次,每次10 min;ECl.化学发光法显影、定影;以斑马鱼阶actin作为内参,用image-Pro Plus图像分析系统对western blotting条带进行蛋白表达的半定量分析。 1. 2. 6流式细胞术(flow cytometry , FCM)检测斑马鱼肾脏细胞周期及分群麻醉后解剖斑马鱼取出肾脏,放人F DTA/肝素钠消化细胞,加预冷的o. 9 x PBS + 5%胎牛血清(fetal bovine septum, FBS) 1 mL; 在40u m滤网上进行过滤;l 000 x g离心5一8 min, 弃上清,收集1 x 105个细胞;加人1 ml PBS或FBS 丙洗I次,将沉淀细胞轻轻吹打均匀,加人预冷的 80%乙醇,终浓度70% ,4 0℃固定18 h以上;次日,上机前1 000 r/min离心5 min,弃固定液;加1 ml. PBS 或FBS洗1次,加人碘化丙陡( propidium iodide, PI) 染液500 uL(含50 ug/mT, PI ,100 ug/mL RNase A ) , 4℃下避光处染色(加PI染液0.5 mL)30 min;FCM 检测:PI用氛离子激发荧光,激发光波长为488 nm , 发射光波长大于630 nm,产生红色荧光分析PI荧光强度的自方图一也可分析前向角散射光(forward scatter, FSc)对侧向角散射光(side scatter , SSC)的散点图,其中FSc代表细胞大小,SSc代表细胞粒度。 1.2.E外周血涂片观察斑马鱼的红细胞和淋巴细胞比例将FIi1-FGFP斑马鱼和F1代转基因斑马鱼 2个月成角分别置于0. 2 m剔mL MS-222中成功麻醉后,在背鳍后部靠近背主动脉区域用剪刀做一侧切口民0. 3一0. 5 cm.见血液流出后用肝素化抗凝处理过的微量移液枪吸取血液制作外周血涂片若干张,待血涂片在空气中干燥后瑞氏一吉姆萨常规染色,采川汕镜观察 1. 3统计学处理 采用SPSS 18. 0软件进行统计学处理。计量资料以干士、表示,两独立样本比较采用Student's,检验P < 0. 05表T差异有统计学意义.
结果
2.1质粒的鉴定及转基因斑马鱼的筛选鉴定 Rag-ICN1-RFP质粒在测序鉴定正确的基础上再进行双酶切鉴定,经Xho I和Hind III双酶切后产物进行DNA凝胶电泳,结果酶切产物与Rag-ICN1段、 pDsRedl-Nl长度相符合,分别对应9. 2 kb和4. 7 kb , 证明重组质粒构建正确(图1). 将构建的质粒显微注射到单细胞期门FIi1-FGFP 品系斑马鱼胚胎中,结果在867条显微注射重组质粒的斑马鱼中,鉴定发现有20条(2. 3 %)转基因阳性斑马鱼,其中1个月左右胸腺表达PLF P的雄鱼9 条,雌鱼11条,称为FO代转基因斑马鱼。在筛选出的FO代成鱼之间采取一对一形式交配,产下的胚胎用同样的方法筛选出RFP阳性的F1代转基因斑马鱼。
2.2验证转基因斑马鱼的表达
2.2.1大体观培养3个月后,在体视荧光显微镜下Rag-ICN1-RFP/flil -EGFI'转基因斑马鱼FO和Fl 代胸腺部位RFP表达阳性,而fTil -EGFP斑马鱼米见 RFP的表达。EGFP的表达在转基因斑马鱼FO和F1 代以及flil -FGFP鱼系中均有表达(图2) 2.2.2 ICNI mRNA的表达以培养1个月的WT,f1i1- EGFP斑马鱼以及FO和F1代转基因斑马鱼的cDNA为模版检测ICN1 mRNA的表达,结果显示WT和fIil- EGFP斑马鱼表达为阴性,而FO和F1代转基因斑马鱼表达均为阳性(图3). 2.2.3 ICN 1蛋白的表达提取30 d的WT,f1il- EGFP,FO代的斑马鱼以及3,7,14,30 d的F1代斑马鱼蛋白,用人源特异性抗体ICN1进行Western blotting 验证,结果显示WT和flil -EGFP斑马角中尤ICN1蛋白的表达,而FO代和F1代转基因斑马鱼中均有 ICN1蛋白的表达(图4) .
2. 3斑马鱼肾脏细胞周期及分群取培养2个月斑马鱼的肾脏细胞进行FCM检测,淋巴细胞周期分析显示:F1代转基因斑马鱼肾脏淋巴细胞G2和S期细胞较f1i 1-EGFP斑马鱼显著增高,并且州代转基因斑马鱼在正常G}峰前出现了亚 G,峰,统计学分析显示其凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.01}(图5A一G);细胞分群将肾脏内细胞划分为红细胞、淋巴细胞以及粒细胞十单核细胞3个细胞群,统计学分析显示:与f1i 1-EGFP斑马鱼比较,F 1 代转基因斑马鱼红细胞明显减少,粒细胞+单核细胞也有所降低,而淋巴细胞显著增加(P<0.01)(图5D)
2. 4外周血涂片观察 观察培养2个月的斑马鱼外周血涂片结果显示,与flit -EGFP斑马鱼相比,转基因F1代斑马鱼红细胞比例明显降低,并且出现成簇的小淋巴细胞和一些原始细胞,与FCM检测结果一致(图6).
3讨论
斑马鱼(zebrafish, I)anio rerio)是近年来新兴发展起来的用于研究脊椎动物肿瘤发病学和发育遗传学的一种模式生物[10,11]作为一种重要的模式动物,其显著优势在于胚胎在体外受精、发育过程能直接连续观察;胚胎在发育旱期呈透明.易于观察和操作;突变体的获得和单倍体、雌核发育二倍体的制作均比较容易;斑马鱼基因组测序已经完成,与人类基因组有85%的同源性,可方便地进行大规模诱变和突变型筛选等研究。 Notch基因于1919年在果蝇中,被首先发现,随后的研究证实Notch厂一泛存在于多个物种中,其家族成员在进化卜高度保守,介导的信号通路更是参与了胚胎发育、血细胞发育以及肿瘤形成等多个病理生理过程[12]。迄今为止,在脊椎动物体内共发现 4种Notch基因13,它们编码了4种单次跨膜受体蛋自,分别为Notch 1一4,其中Notchl信号通路参与1 正常丁细胞发育的各个阶段6在淋巴细胞发育甲- 期,进人胸腺的共同淋系前体细胞(common lymphoid precursors, CLP)只有在接受Notchl信号后才可定向分化为T细胞,反之则发育为B细胞[14]。当ClP向 'I'细胞系定向分化形成原T ( Pro-'T)细胞后,Notchl 能促进Pro-T细胞优先地向。αβT细胞发育而不是向 γδT细胞发育[15]。
Notchl信号通路的激活经历三步水解形成胞内区活性部分ICN1后从细胞膜上游离出来,并最终转位到胞核内发挥作用本研究FCII 检测结果显T,斑马鱼胚胎转人ICN1基因后,成鱼主要的造血器官肾脏内红系造血明显受到抑制,'F淋巴细胞的比例显著增加,处于G,和S期的T淋巴细胞比例也明显提高,并且出现了亚G峰外周血涂片结果显示:与fli 1-EGFP斑马鱼相比,转基因F1代红细胞比例明显减少,并且出现成簇的小淋巴细胞和一些原始细胞,以上均提示I(:N1对于促进「细胞增殖甚至恶性转化起到了积极作用。 Isogai等[16]构建了flil -EGFP转基因斑马鱼系,观察并比较了W'F和突变体的斑马鱼(f1i1-EGFP )胚胎模型血管发育过程,为进一步鉴定分析调控血管发育相关分子提供了较好的工具。
在本研究中,我们在该斑马鱼系(flil -EGFI')中,应用Rag2启动子,驱动ICN1基因并携带RFP,建立了红绿双荧光示踪的双转基因斑马鱼T-AIL模型,至今为止尚米有人建立过此模型。本模型与2007年Chen[7]等建立的 Ra粼-ICNI-ECFP斑马鱼T-}1LL模型相比,能较好地 显示血管发生与T-AI,L之间的位置关系建系后的斑马鱼成鱼在显微注射后一个月左右开始用荧光显微镜进行活体观察筛选,将同时有绿色荧光标记的血管网和红色荧光标记的白血病受累组织的成鱼挑选出来进一步验证。然后,我们又在mRN4水平和蛋白水平验证了筛选的成鱼L氏F1代中ICN1的表达。最后,用FCM进行了阳性成鱼主要造血器官肾脏内的淋巴细胞周期分析和细胞分群分析,并进行了外周血涂片观察,说明1CN1诱导的T-ALL斑马负双荧光示踪模型已成功建立。本模型可用于在体实时动态观察Notch信号通路异常激活对淋系造血和血管新生的影响。为今后研究T-ALL发病过程中血管形成的相关变化以及利用斑马负作为平台进行大规模药物活性成分体内实验筛选打下了基础.
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