产气肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制研究

碳青霉烯类抗生素被认为是最有效的治疗多重耐药肠杆菌科细菌感染的广谱抗生素之一。但随着临床上广泛使用此类抗生素，世界各地有关耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌陆续被报道。近年来，此类菌株在我国检出率也日益增多，有的甚至引起医院爆发流行，这给临床抗菌药物治疗和医院感染控制带来了极大的挑战。本研究对临床痰标本分离得到的不重复16株耐碳青霉烯类抗生素的产气肠杆菌进行耐药机制研究，结果报道如下。材料与方法 1. 1材料 1. 1. 1菌株来源收集2009年6月一2010年3月在上海交通大学医学院附属新华医院临床分离得到的非重复耐碳青霉烯类抗生素产气肠杆菌16株 (EA1 -EA16 )，其中10株来自急诊病区患者的痰液标本，另外6株来自急诊ICU患者的痰液标本。 1. 1. 2质控菌大肠埃希菌ATCC25922,铜绿假单 胞菌ATCC27853和肺炎克雷伯菌ATCC700603由上海市临床检验中心提供;产KPC-2酶肺炎克雷伯菌 ( LYKPC由上海交通大学附属第六人民医院检验科惠赠;IMP和VIM阳性菌株由上海交通大学医学院附属瑞金医院微生物科惠赠。 1. 1. 3培养基和主要试剂Vitek 2 Compac[全自动微生物分析系统及革兰阴性杆菌鉴定卡(GNI、革兰阴性杆菌药敏卡(GN13)购自法国Bio Merieux公司; Mastercycler EP Gradient Thermal Cvcler PCR仪购自德国Eppendorf公司;ABI Prism 310 Genetic Analyzer DNA测序仪及基因测序扩增试剂盒购自美国Applied Biosystems公司;聚丙烯酸胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 装置及电泳仪购自美国Bio-Rad公司;PCR扩增试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(卜海) 股份有限公司公司;美罗培南纸片(10 ug)购自英国 Oxoid公司;血平板、麦康凯平板和M-H平板购自上海伊华生物技术有限公司. 1.2方法 1.2.1细菌鉴定和药敏试验所有菌株均由Vitek- 2 Compact全自动微生物分析仪进行鉴定及药敏试验，药敏判断标准按照2011年美国临床实验室标准化研究所( Clinical and Laboratory Standards Institute, C I.SI )的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》‘。 1. 2. 2改良Hodg。试验根据CLSI'-z}的推荐，将 0. 5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922菌液稀释10 倍后均匀涂布在M-H平板上，中间贴10 p到片美罗培南的纸片，将实验菌株以美罗培南纸片为起点，沿离心方向划线，35℃培养过夜，抑菌圈内呈现矢状者为阳性。肺炎克雷伯菌ATCC700603为阴性对照株，肺炎克雷伯菌LYKPC作为阳性对照株。 1. 2. 3 PCR基因扩增及测序水煮法提取菌株 D'V A。采用PCP技术扩增碳青霉烯酶基因，包括 KPC-2、IMP-1、IMP-2、VIM-1、V f A-I -2、N' D IV1一卜OXA-1 和OYA-9基因。引物及扩增条件见表1[4-9]基因经PC R扩增后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪观察并拍照。 1.2.4基因测序待测序的PCR扩增阳性产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，割取对应位置的含清晰 DNA条带的琼脂凝胶块，用DNA胶回收试剂盒回收得到测序单向PCR反应的模板，单向PC#I反应的具体体系与扩增程序参考BigDye Terminator v3. 1测序扩一增试剂盒操作手册，单向PC I}反应产物利用ABl Prism 310 Genetic Analyzer DMA测序仪进行测序。 1.2.5外膜蛋白分析参照文献’。采用超声破壁法提取菌株外膜蛋白，外膜蛋白样品经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析并拍照。 2结果 2.1菌株鉴定及药敏试验结果 16株细菌经\Vitek-2 Compact微生物全自动鉴定药敏分析系统鉴定均为产气肠杆菌。药敏试验结果显示:16株菌株对厄他培南和亚胺培南均耐药，并对呱拉西林/他哩巴坦、头袍替坦、头袍他陡、头泡毗肪、氨曲南、阿米卜星、庆大霉素和环丙沙星呈现出多重耐药(表2) 2. 2改良Hodge试验结果 16株产气肠杆菌的改良日。}lge试验均呈阳性结果(图1)。 2. 3 PCR扩增及测序结果 分别将8种耐药基因进行PCR扩增，16株产气肠杆菌均扩增出1 000帅左右的KPC-2基因阳性扩增条带(图2)。利用ABI Prism 310 Genetic Analyzer DNA测序仪对扩增产物进行基因测序，经序列经 Blast软件(http;//wives. ncl>i. nlm. nih. aov/)比对，证实为I<PC-2酶基因;l IMP-七LMP-2, VIM-1 , V工M -2 ,NDM-七oxa-1和oxA-9型耐药基因均未检出。

2. 4外膜蛋白分析

采用SDS-PAGE离产气肠杆菌野生株检测EA1一EA16及1株临床分EA17外膜蛋白的表达，结果显示:与野生株比较，5株菌株(EA2,EA4,EA7,EA13和EA15)在相对分子量为36 000左右位置缺失蛋白条带(图3)。

3讨论

产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类抗生素的主要耐药机制之一。在肠杆菌科细菌中，已发现的碳青霉烯酶主要是A类酶和B类酶,D类酶也已在肠杆菌科细菌内发现。A类碳青霉烯酶可水解碳青霉烯类、头抱菌素类、青霉素类和氨曲南等抗菌药物，它包括SME, IMI, NMC , GES和KPC等家族[11]，其中，KPC型碳青霉烯酶是最普遍流行的。首次由美国Yigit等[12]于2001年在肺炎克雷伯菌中发现，命名为肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶一1  ( K. pneu-moniae carbapenemase-1 , KPC-1，该细菌表现出对亚胺培南和美罗培南高度耐药，KPC酶为可水解碳青霉烯类药物的日一内酞胺酶，属于Ambl。分类A类酶或Bush分类2f组。2003年有报道在肺炎克雷伯菌中发现KPC-2[4]。迄今为止，全球范围内已发现报道了13个亚型的KPC型酶[13]。自2007年起，我国也陆续报道了有关肠杆菌科细菌产KPC酶，目_主要是产KPC-2酶。B类酶包括IMP, VIM’‘〕和新发现的NDM-1[7]等金属酶。D类OXA型酶在肠杆菌科中也有发现，不同细菌产oxA型酶也有所差异，有报道产气肠杆菌产OXA-1型酶[8]和OX A-9型酶[9]。

本研究中的16株耐碳青霉烯类抗生素的产气肠杆菌的改良Hodge试验结果均为阳性，表明这16株均产碳青霉烯酶。用PC R方法和基因测序确证16株菌株均产KPC-2基因，但未检出IMP-1 , IMP-2 ,VIM-1 ,V1M-2, NDM-1 , OXA-1和OXA-9等其他碳青霉烯酶基因。在已有的有关肠杆菌科细菌产KPC酶的报道中，检出菌大都属于肠杆菌科的肺炎克雷伯菌，其他种类的肠杆菌科细菌也有报道，但产气肠杆菌较为少见，尤其这16株产气肠杆菌均产KPC-2型基因，这在国内乃至国际上都是首次，应引起高度重视。

细菌外膜蛋白缺失或数量的减少，引起外膜通透性的改变是导致细菌耐碳青霉烯类抗生素的重要机制之一。产气肠杆菌的外膜蛋白主要有3种，Omp36 ,Omp35和OmpA，其中Omp36和Omp35在药物渗透进人细胞过程中起主要作用[14-19]。本研究对16株耐碳青霉烯类抗生素的产气肠杆菌用SDS-PAGE方法进行外膜蛋白分析，结果有5株菌株缺失Omp36膜孔蛋白。综_L所述，本研究中的16株耐碳青霉烯类抗生素产气肠杆菌的主要耐药机制为产KPC-2酶，同时部分菌株合并Omp36膜孔蛋白的缺失。

产气肠杆菌能引起机会感染和医院内感染，可在患者的呼吸道、泌尿生殖道、脓液和血液等标本中检出，是肠杆菌科肠杆菌属中最常见的临床分离菌。虽然有关产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌报道越来越多，但产KPC-2型基因的产气肠杆菌还比较少见，国内外仅有散发菌株报道。本研究中的I6株耐碳青霉烯类抗生素的产气肠杆菌均含KPC-2基因，目.分离自急诊ICU和急诊病房患者的呼吸道标本，并已经ERIC-PCR基因图谱分析，证明具有同源性，

提示在我院存在克隆株流行的可能a,，因此，加强耐药菌株的监测并采取有效的消毒隔离措施，刘一防止耐药菌的播散流行显得尤为重要。

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