HDAC6表达载体转染对胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响

作者                 作者单位

李光明   兰州大学临床医学院，甘肃 兰州 730000

卢启明　 甘肃省人民医院消化内科，甘肃 兰州 730000

0引言

肿瘤的发病机制十分复杂，近十余年来，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)在肿瘤发生中的作用已成为研究热点. 目前的研究多集中在Ⅰ类HDACs，认为其主要通过使核心组蛋白去乙酰化，导致染色质的空间构象由疏松型转为紧密型，从而引起某些肿瘤抑制基因转录抑制. HDAC6与肺癌、乳腺癌和口腔鳞癌等实体瘤的发生发展密切相关[1-3]，但有关HDAC6在胃癌发病机制中的重要作用，目前还少见文献报道. 本实验通过将HDAC6真核表达载体转染胃癌细胞SGC7901，使HDAC6过表达，观察其对胃癌细胞增殖及对常规化疗药物顺铂敏感性的影响，初步揭示HDAC6与胃癌发生的关系.

1材料和方法

1.1材料人胃癌细胞株SGC7901，BGC823(兰州大学医学实验中心提供);RPMI1640细胞培养基(美国Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);胰酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、AnnexinvFITC凋亡检测试剂盒(美国Sigma公司);兔抗人HDAC6多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司);SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司);G418(德国Merk公司);阳离子脂质体LipofectamineTM 2000(美国Invitrogen公司);顺铂(cisdiamminedichloroplatinum，CDDP)(山东齐鲁制药厂);HDAC6表达载体pCDNA3.1HDAC6FLAG(美国匹兹堡大学艾军魁博士构建并惠赠，pCDNA3.1质粒具有新霉素抗性基因).

1.2方法

1.2.1细胞培养将胃癌细胞株SGC7901，BGC823分别培养于RPMI1640(含100 mL/L小牛血清、10万U/L青霉素、10万 U/L链霉素)细胞培养液中，置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中常规培养. 取对数生长期的细胞用于实验.

1.2.2免疫细胞化学取1 cm2盖玻片放入6孔板中，将对数生长期的胃癌细胞SGC7901，BGC823分别制成1×108/L单细胞悬液，每孔1 mL加入6孔板中，分别接种12孔，常规培养，细胞融合度达50%～60%时，小心移出玻片，PBS漂洗，750 mL/L乙醇固定. 按常规免疫细胞化学法分别检测HDAC6基因在两种细胞中的表达水平. 染色结果用计算机图像分析系统处理，自动记录吸光度A值，每张切片取5个视野,取A均值. 选取HDAC6表达水平相对高的细胞株作为进一步的实验对象.

1.2.3G418筛选浓度的确定密度为1×106/L的单细胞悬液按每孔1 mL接种于24 孔板,G418按0，100～1100 mg/L 的终浓度依次加入各孔中, 观察细胞的生长状况, 以第10日细胞全部死亡的最低浓度为G418的筛选浓度.

1.2.4细胞转染实验分为HDAC6表达载体pCDNA3.1HDAC6FLAG转染组(转染组)，空载体pCDNA3.1转染组(空载体转染组)及非转染组3组. 转染前按4×105个细胞/孔，在6孔板中接种对数生长期的胃癌细胞SGC7901，常规培养过夜. 细胞融合度达60%～80%时，更换无血清、无双抗RPMI 1640培养液,按LipofectamineTM 2000试剂盒说明书进行转染. 6 h后除去转染试剂，更换成常规培养液继续培养过夜. 转染后24 h，将细胞以1∶10的的比例传代至含G418(浓度为600 mg/L)的选择性培养液中继续培养，每周用该选择性培养液换液1次，8 wk后，随机挑取各组细胞克隆并扩大培养. 稳定转染后的各组细胞分别命名为SGC7901HDAC6+，SGC7901neo和SGC7901.

1.2.5Western Blot检测将对数生长期的胃癌细胞SGC7901HDAC6+，SGC7901neo和SGC7901细胞制成单细胞悬液，分别取6×106个细胞， 2000 r/min离心10 min, PBS洗2次. 裂解细胞, 以Bradford法测定细胞蛋白浓度. 将样品的蛋白浓度调整一致, 各取20 μL上样行SDSPAGE, 电泳后转至NC膜上, 含10 g/L脱脂奶粉的TPBS室温封闭2 h,加入HDAC6多克隆抗体(工作浓度为1∶1000)，室温孵育过夜， 再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶2000)室温孵育2 h, DAB显色. 晾干的NC膜用Mcrotec scanMaker E6扫描仪扫描，Quantity One 4.1图像分析软件测定各显色条带的A值.

1.2.6MTT法检测将对数生长期的各组胃癌细胞分别制成单细胞悬液，以每孔2×103个细胞接种于96孔板，每孔体积200 μL，每组设6个复孔，其中1孔做调零用，常规培养. 培养至24，48，72，96和120 h时，每组各孔分别加入MTT(5 g/L)20 μL，继续培养4 h，终止培养，小心吸出上清液，加入DMSO 150 μL, 微振荡10 min，使紫兰色沉淀完全溶解，用酶标仪于490 nm波长处测每孔的A值. 以时间为横坐标，每组平均A值为纵坐标，绘制细胞生长曲线.

1.2.7平板克隆形成试验生长旺盛的各组胃癌细胞分别接种于直径为60 mm的培养皿，每组设3个平行皿，每皿依次含50，100，200个细胞，常规培养2 wk，培养皿中出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养. 弃培养液，PBS浸洗,750 mL/L乙醇固定，姬姆萨应用液染色. 将干燥后的培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，肉眼直接计数克隆数，按下式计算克隆形成率：克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%

1.2.8流式细胞仪检测将对数生长期的各组胃癌细胞分别以2×108/L的密度接种于50 mL细胞培养瓶，常规培养24 h. 细胞融合度达80%时，加入CDDP并使其终浓度为10 mg/L，继续培养48 h后收集细胞(贴壁和游离细胞)，调整细胞密度为1×109个/L. 取1 mL细胞冰冷PBS洗涤2次，200 μL结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL Annexin ⅴFITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min,加入300 μL结合缓冲液，立即上机检测. 每组重复检测3次.

统计学处理：采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1HDAC6在胃癌细胞中的表达经免疫细胞化学法检测，胃癌细胞SGC7901,BGC823的细胞质中均可见HDAC6表达，其表达水平依次为0.28±0.07， 0.19±0.04 . 胃癌细胞SGC7901明显高于BGC823, 差异具有统计学意义( P<0.05,图1).

A: HDAC6在SGC7901胞质中的表达; B: HDAC6在BGC823胞质中的表达.

图1HDAC6在胃癌细胞中的表达SP ×400

2.2细胞转染各组细胞经脂质体介导法转染，G418(600 mg/L)加压筛选8 wk后，HDAC6表达载体转染组和空载体转染组可见细胞克隆生长，而非转染组细胞全部死亡，说明细胞转染成功.

2.3转染细胞中HDAC6蛋白的表达经Western Blot法检测，在蛋白总上样量一致的前提下，HDAC6表达载体转染组、空载体转染组和非转染组各组细胞的A值分别为：3592±238，1900±133和1686±177，转染组较空载体转染组和非转染组显著升高(P<0.05)，HDAC6表达被增强，空载体转染组和非转染组之间差异无统计学意义(P=0.633，图2).

1:HDAC6表达载体转染组; 2:空载体转染组; 3:非转染组.

图2Western Blot检测HDAC6在转染细胞中的表达

2.4细胞生长曲线MTT法连续5 d检测各组细胞增殖情况，结果表明，HDAC6表达载体转染组细胞增殖能力明显高于空载体转染组和非转染组. 空载体转染组和非转染组之间细胞增殖能力差异无统计学意义(图3).

2.5各组细胞克隆形成率通过克隆形成试验，HDAC6表达载体转染组、空载体转染组和非转染组各组的克隆形成率依次为：(26.10±1.28)%，(18.60±1.28)%和(16.17±1.53)%，转染组明显高于空载体转染组和非转染组(P<0.05)，空载体转染组和非转染组差异无统计学意义(P=0.215).

图3细胞生长曲线

2.6各组细胞凋亡率各组细胞与顺铂作用48 h后，经流式细胞仪检测(双染)，HDAC6表达载体转染组、空载体转染组和非转染组各组细胞的凋亡率依次为：(10.46±0.65)%，(20.59±0.88)%和(22.31±1.40)%，转染组明显低于空载体转染组和非转染组(P<0.05)，空载体转染组和非转染组之间差异无统计学意义(P=0.2585).

3讨论

研究表明，选择性HDAC6抑制剂与抗肿瘤药物紫杉醇联合作用，可协同抑制雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF7的生长[4]. 免疫组化检测发现，HDAC6的表达水平在肺癌[1]和乳腺癌[2]组织中的表达水平与肿瘤的预后呈负相关，在口腔鳞癌[3]中HDAC6的表达水平与肿瘤的侵袭性具有明显的相关性. 而HDAC6与胃癌发生发展之间的关系,目前少见有文献报道. 我们通过研究发现，HDAC6稳定表达于胃癌细胞SGC7901和BGC823的细胞质中，转染了HDAC6表达载体的SGC7901细胞其细胞增殖能力较未转染组明显增强，同时，转染组细胞的抗凋亡能力亦显著提高. HDAC6促进肿瘤发生的确切机制目前尚不清楚. 研究表明，HDAC6可增强缺氧诱导因子1α(hypoxiainducible factor1α，HIF1α)和热休克蛋白90(heat shock protein 90)的生物学功能，可能是二者的上游调节因子[5-7]. 已知HIF1α和HSP90可促进多种肿瘤(包括胃癌)的发生发展，是重要的致瘤因子. 据此可以推测，本实验中HDAC6促进胃癌细胞增殖、抑制其凋亡，其部分机制可能是通过增强HIF1α和HSP90的生物学功能而实现的.

【参考文献】

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