肝癌靶向性AGAP表达载体构建及生物信息学分析

作者                     作者单位

金思思   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州

吴金明   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州

黄智铭   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州

吴建胜   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州

申苏建　 温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州

Abstract: Objective: To construct a gene-modified hepatocellular carcinoma?(HCC)?specific AGAP expression vector regulated by the cis-acting element of AFP. The physicochemical property and structural characteristics of the protein were analyzed and predicted by computer-aided analysis to establish a basis for exploring biotoxin thepapy for tumor. Method:?The AGAP DNA fragment was amplified through RT-PCR from the total RNA of Chinese Buthus Martensii Karsch. It was then cloned into the plasmid pGL3/AFP. The recombinant plasmid pAFP-AGAP was identified by restriction endonucleases and nucleotide sequence. The protein analysis software were utilized to predict the flexibility，hydrophilicity，and antigenicity of the new AGAP protein. Then the expression levels of AGAP mRNA were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction?(RT-PCR)?after the recombinant plasmid being transfected into HepG2 cell line. Results:?Through the analysis of the software，?it could be found that the secondary structure of the new AGAP didn’t almost changed and remain their biologic activity. The recombinant plasmid was successfully to express AGAP mRNA in HepG2 cell line. Conclusion:?The recombinant vector is constructed successfully.

Key words: ?alpha fetoprotein;analgesic-antitumor peptide;eukaryotic expression vector; hepatocellular carcinoma

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，是我国癌症患者病死率最高的疾病之一。手术、放化疗及介入等常规治疗效果均不理想，不能从根本上改善患者的预后。目前，利用基因工程的手段，实现AFP转录调控序列驱动目的基因表达，对肝癌进行基因治疗，是肝癌治疗的热点[1]。另外，蝎毒是一种毒性仅次于蛇毒的生物毒素，早在宋代全蝎就被用于治疗惊厥、癫痫及肿瘤等疾病。很多人试图从蝎毒中提取有抗肿瘤活性的组分，开发有效的、相对毒副作用较小的新药。近年来，东亚钳蝎毒(Buthus martensii Karsch)的药用研究是我国生物毒素方面研究和开发的热点之一。东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(Analgesic-antitumor peptide，AGAP)就是从东亚钳蝎毒中分离出的一种有效的抗肿瘤成分，对多种肿瘤细胞有细胞毒作用，并对动物移植癌有抑制作用[2-3]。本实验利用基因工程手段，构建重组质粒，实现AGAP细胞内直接表达，省去了蝎毒分离、纯化等繁琐步骤，为进一步研究其在肝癌基因治疗中的作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料 携带有效AFP启动子和增强子组合的质粒pGL3/AFP由Cheng Qian(Fundación para la Investigación Médica Aplicada)构建馈赠。菌株DH5α和人肝癌细胞(HepG2)由本室冻存。RNA提取试剂(RNAiso Reagent)、逆转录试剂盒(BCa BESTTM RNA PCR Kit Ver 1.1)购自大连宝生物公司，各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒(EZ Spin Col-umn Plasmid DNA Minipreps Kit)购自BBI公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司，DMEM培养基购自HyClone公司，胰酶购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 引物设计 根据GeneBank中AGAP(AF464898)能表达66个成熟肽的基因序列及pGL3/AFP序列进行引物设计。AGAP基因上游引物顺序为：5’- CATGCC ATGGCCGTACGCGATGGTTATATTGCCG -3’，引入了Nco I酶切位点，下游引物顺序为：5’- TGCTCTAGAGACCG CCATTGCATTTTCCTG -3’，引入了Xba?I酶切位点，酶切位点已含起始密码和终止密码。

1.3 AGAP基因克隆 取新鲜的蝎尾，抽提RNA，按试剂盒步骤操作。利用RT试剂盒反转录出cDNA第1链，引物采用Oligo dT，条件为：65 ℃ 1 min、30 ℃ 5 min、65 ℃ 20 min、98 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。采用高保真Taq酶进行随后的PCR反应。PCR条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，28个循环，末次72 ℃延伸5 min。取PCR产物电泳，后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收待用。

1.4 pAFP-AGAP真核表达载体构建及鉴定 取质粒pGL3/AFP用Nco?I和Xba?I双酶切，将所需载体片段4?188 bp经电泳分离出并回收。胶回收的AGAP基因片段经Nco?I和Xba?I双酶切，获目的基因201 bp与所需载体片段4?188 bp按3:1的比例混合，加入T4 DNA连接酶进行连接反应，16 ℃过夜。将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，扩增后质粒提取试剂盒提取。新构建重组真核表达载体pAFP-AGAP(见图1)酶切鉴定并测序。双向测序由华大基因完成。

1.5 生物信息学分析 DNA测序验证重组质粒pAFP-AGAP的方向性和正确性，双向序列测定由华大基因公司完成，测序结果使用Gene bank Blast进行比对;采用Vector NTI软件对pAFP-AGAP序列进行读框(ORF)分析，然后用Translation程序推导并输出氨基酸序列;应用www.expasy.org网站提供的ProtParam方案以及DNAStar软件中的Protean程序进行蛋白理化性质分析。

1.6 重组质粒实现细胞表达 HepG2细胞复苏后置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素DMEM培养液中，37 ℃，体积分数5 %CO2条件下培养。转染前1 d，用新鲜无抗性培养液调整细胞密度为1×105/mL，以每孔2 mL接种于6孔板培养过夜。次日将质粒pAFP/AGAP与脂质体(g/L)以1:3比例混合后转染HepG2细胞，按LipofectamineTM 2000说明书操作。转染后24 h，Trizol提取每孔细胞的RNA。RT-PCR 法检测AGAP mRNA表达(条件同上)，其扩增产物电泳并测序鉴定。双向测序由华大基因完成。

2 结果

2.1 AGAP基因克隆 提取的总RNA A260/A280比值为1.82，表明总RNA较纯。以反转录的cDNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增，所得特异性条带208 bp与预期长度相符(见图2)。

2.2 重组质粒酶切鉴定 重组质粒pAFP-AGAP经Nco?I和Xba?I双酶切为201 bp和4?149 bp两片段，Xba?I单酶切符合4?395 bp大小，还用Kpn?I和Xba?I双酶切pAFP-AGAP便于观察，得3?081 bp和1?308 bp两个片段(见图2)。

2.3 生物信息学分析 pAFP-AGAP经双向测序结果证实融合基因插入方向正确，经Gene bank Blast比对，有98%的碱基与GenBank序列相同，部分不同可能由基因突变或者基因克隆过程中错配引起。结果显示AGAP基因序列与原设计相符。重组质粒Vector NTI读框分析表明，含AFP顺式作用元件的真核表达载体pAFP-AGAP下游插入了完整的目的基因AGAP，起始密码ATG，终止密码TAG，编码68个氨基酸。ProtParam分析显示，该AGAP蛋白分子量：16?355.9 Da，等电点：5.36，分子式： C606H1010N204O257S34，半衰期： 30 h(哺乳动物)，不稳定系数: 20.97，该蛋白分类为稳定蛋白。DNAStar软件中的Protean程序分析，本实验所表达的AGAP蛋白与GeneBank中AGAP蛋白，虽然序列有两个碱基不同，并未完全正确表达增加的碱基数，但柔性、亲水性、抗原性未发生改变，也没有新的表位出现，二级结构也基本相同(见图3)。因此，我们可以预测pAFP-AGAP能正确表达AGAP，并与传统蛋白分离后的AGAP成分有相同的效果。

2.4 RT-PCR方法测重组质粒在细胞中的表达 电泳结果(见图4)显示HepG2细胞存在AGAP mRNA的表达，证实构建的重组质粒能正确读码并转录表达。

3 讨论

从1968年Abelev将甲胎蛋白(AFP)作为肝癌的肿瘤标志物到现在，可谓历史悠久。后来发现许多肿瘤标志物的表达受该肿瘤特异性顺式作用元件或反式作用因子的调控，故可将目的基因置于此类肿瘤特异性调控序列的调控之下，使目的基因(特别是细胞毒性基因)在肿瘤细胞中特异性地表达，而不影响其他组织，可实现肿瘤的靶向基因治疗。Kunitomi等[4]将白喉毒素片段A基因(DTA)连接在AFP启动子下游，作用于肝癌组织， 结果肝癌细胞中DTA基因大量表达并促使肿瘤细胞死亡。但后来发现，用AFP基因全部5’-端序列作为调控，专一性不好。Ido等[5]研究发现，人300 bp AFP启动子有效长度足以在人、大鼠细胞中启动目的基因表达。由于AFP的表达很大程度上依赖于增强子的活性，一些研究者试图利用其增强子的功能来增强转染基因的表达。Kanai[6]将AFP基因的启动子和增强子同时与自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)基因融合，转染肝癌细胞，使CD基因在肝癌组织特异性高效表达。

此外，传统的中医药在调节机体免疫功能方面有着西药无可取代的作用，是很好的抗肿瘤药物。其中，中药蝎毒广为应用，我国华南、华东地区的东亚钳蝎也称马氏钳蝎更是丰富。蝎毒成分复杂，AGAP是Liu等[7]分离纯化得到的单组分活性肽，兼有抗肿瘤活性和镇痛活性于一体。AGAP成熟肽含有66个氨基酸残基，从一级结构分析，推测是Na+离子通道抑制剂，但是AGAP具体的作用机制不明确。现已发现，蝎毒对人低分化鼻咽上皮癌细胞株、B16黑色素瘤[8]、卵巢癌细胞HO-8910[9]、结肠癌细胞等多种恶性肿瘤都存在抑制作用。孔天翰等[2-3]也证实，蝎毒对人食管癌细胞、人喉癌细胞、人直肠腺癌细胞、人肝细胞癌细胞(SMMC-7721)、人胃癌细胞等多种人肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用，体内动物实验还发现可明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长。

考虑到以上的因素，本实验正是利用含最短最有效AFP启动子和增强子组合的质粒pGL3/AFP来作为载体来构建重组质粒，实现高效的表达，为肝癌的基因靶向治疗提供了有力工具。实验结果显示，我们构建的重组质粒pAFP/AGAP，软件分析结果表明，所表达的目的蛋白α螺旋、β折叠等二级结构，以及亲水性、柔性、抗原性、表位等生物学活性几乎未受到影响，而且所构建质粒转染细胞后成功完成转录表达。因此，利用计算机辅助分析和预测蛋白质的理化和结构特征可使我们很好地了解所表达蛋白质的生物功能，对进一步的研究具有一定的指导性，而且可节省很多的时间和开支[10]。

【参考文献】

[1] Schmitz V, Qian C, Ruiz J, et al. Gene therapy for liverdiseases: recent strategies for treatment of viral hepatitisand liver malignancies[J]. Gut,2002,50(1):130-135.

[2] 孔天翰,林山,韩雪飞,等.蝎毒多肽对肿瘤细胞的抑制作用研究[J].中国病理生理杂志,2004,20 (6) :968-972.

[3] 魏玲,董伟华,孔天翰.东亚钳蝎毒抗癌多肽对人肿瘤细胞系和动物移植瘤的作用[J].中国癌症杂志,2002,12(2):97-101.

[4] Kunitomi M, Takayama E, Suzuki S, et al. Selective inhibi-tion of hepatoma cells using diphtheria toxin A under thecontrol of the promoter/enhancer region of the humanalphafetoprotein gene[J].Jpn J Cancer Res,2000,91(3):343-350.

[5] Ido A, Nakata K, Kato Y, et al. Gene therapy for hepatomacells using a retrovirus vector carrying herpes simplex virusthymidine kinase gene under the control of human alpha-fetoprotein gene promoter[J].Cancer Res,1995,55(14):3105-3109.

[6] Kanai F.Transcriptional targeted gene therapy for hepato-cellular carcinoma by adenovirus vector[J]. Mol Biotechnol,2001,18(3):243-250.

[7] LiuY F, Hu J, Zhang J H,et al.Isolation, purification, and N-terminal partial sequence of an antitumor peptide from thevenom of the Chinese scorpion Buthus martensii Karsch[J].Prep Biochem Biotechnol,2002,32(4):317-327.

[8] 付士波,鞠桂芝,杨英.蝎毒对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用[J]. 吉林大学学报:医学版,2004,30 (2):178-181.

[9] 戚潜辉,陈盛强,李锦玉.蝎毒抗癌多肽对卵巢癌细胞HO-8910生长的抑制作用[J].广州医药,2008,39(4):7-9.

[10] 李志群,马英骥,成军,等.乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白1基因的克隆及生物信息学分析[J].中华实验和临床感染病杂志, 2008,2(3):162-168