非小细胞肺癌中磷酸化蛋白激酶B及血管内皮生长因子蛋白的表达

作者             作者单位

李侠   山东省职业病医院呼吸科,山东,济南,250002

王玲   山东省职业病医院呼吸科,山东,济南,250002

高锡刚 山东大学齐鲁医院呼吸  

高娟   山东大学齐鲁医院呼吸

李淑岷 山东省博兴县中医院

AKT蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因与蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)在结构上很相似，因此，又被命名为蛋白激酶B(PKB)，其功能的发挥有赖于位点的磷酸化。研究发现,在许多人类肿瘤中存在AKT频繁激活,并通过磷酸化其下游的多种作用底物促进肿瘤血管生成、细胞的侵袭、转移〔1〕。而肿瘤的生长必须有新生血管提供营养，血管内皮生长因子(VEGF)可以改变内皮细胞基因的活化，诱导血管的形成〔2〕;AKT可以通过多种途径促进血管的生成。目前关于磷酸化蛋白激酶B(PAKT)在肺癌中表达的报道甚少，尤其是肺癌组织中AKT活化与肿瘤血管生成的研究鲜见报道。我们通过观察肺癌组织和正常肺组织中PAKT、VEGF的表达，探讨AKT的活化与肿瘤的发生发展及其血管生成的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 标本来源于山东大学齐鲁医院病理科，均为该院2004年6月至2006年6月经常规病理切片证实的非小细胞肺癌(NSCLC)61例，男40 例，女21例，年龄34～79岁，平均60.0岁。依据1997年新的修订标准进行TNM分期〔3〕,其中Ⅰ期15例，Ⅱ期15例，Ⅲ期24例，Ⅳ期7例;按病理形态学分为：鳞状细胞癌32例，腺癌29例;按分化程度分为：高分化4例,中分化24例，低未分化33例;按有无淋巴结转移分为：有淋巴结转移32例，无淋巴结转移29例;患者均为原发性肺癌，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗;肺癌组织取自肿块中央非坏死部分。取肺良性瘤样病变周围5 cm以上正常组织20例，其中结核球8例，肺平滑肌瘤2例，错构瘤3例，炎性假瘤7例;所有标本术后均经HE染色法重复染色，由两位病理医生会诊后确诊;标本经10%福尔马林固定，常规脱水石蜡包埋。

1.2 主要试剂及检测方法 PAKT兔抗人单克隆抗体由美国Cell Signaling生物技术有限公司提供，工作浓度为1∶50;VEGF鼠抗人单克隆抗体及SP试剂盒均为即用型由北京中山生物技术有限公司提供。将标本制成4 μm厚连续石蜡切片，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法染色，用PBS代替一抗作为阴性对照，步骤按说明书。

1.3 结果判断及统计学处理 光学显微镜下观察PAKT阳性蛋白为细胞浆染色呈淡黄色至棕黄色，PAKT按着色细胞百分数计分〔4〕：0%记为0分，1%～50%记为1分，51%～100%记为2分。按染色强度计分：细胞未染色0分，染色较弱为1分，中度染色为2分，强染色为3分。最后以阳性细胞的百分比记分和染色强度记分之和进行结果判定：0～2分为阴性(-),3～5分为阳性(+)。VEGF按照Vlom等〔5〕的评判标准：选染色均匀的癌间质区，在400倍视野下，以着色细胞占视野细胞总数的多少分为0～3级。0级：0;1级：<25%;2级：26%～50%;3级：>50%。0级为阴性，1级以上为阳性。

1.4 统计学处理 数据用率(%)表示，采用χ2检验，用SPSS10.0软件进行统计学分析。

2 结 果

2.1 肺癌、肺良性病变组织中PAKT、VEGF的表达 PAKT蛋白表达阳性染色主要定位于肺癌细胞胞浆中，为粗细不一的棕黄色颗粒，在61例肺癌组织中27例PAKT蛋白表达阳性，20例正常肺组织中未见PAKT蛋白的表达。61例NSCLC组织中PAKT蛋白表达(44.3%)明显高于癌旁组织(0%)，二者有显著性差异(P<0.05)。VEGF阳性物为棕黄色颗粒状，主要位于肿瘤细胞的胞浆中，以肿瘤组织周边部位及坏死区域周围肿瘤细胞表达较强，肺癌组织内巨噬细胞、部分血管内皮细胞及成纤维细胞也呈阳性。本组61例NSCLC中，VEGF阳性37例，阳性率61.6 %，20例正常肺组织中5例阳性，阳性表达率25%，两者之间有显著性差异(P<0.05)，见图1。

2.2 PAKT、VEGF表达与肺癌患者临床病理特征的关系 肺癌组织中PAKT蛋白表达与患者的年龄、性别、吸烟、组织类型、TNM分期及淋巴结转移等无明显关系，而与肿瘤的分化程度明显相关。VEGF的表达与患者的年龄、性别、吸烟及肿瘤的分化程度等无明显关系;而与TNM分期、组织类型、淋巴结转移明显相关，见表1。表1 不同蛋白表达与NSCLC临床病理特征的关系

2.3 肺癌组织中PAKT、VEGF表达的相互关系 在27例PAKT阳性病例中VEGF阳性22例，阴性5例，而在37例VEGF阳性病例中，PAKT阳性22例，阴性15例。经统计学检验表明，二者呈正相关关系(r=0.38，P<0.05)。

3 讨 论

AKT是PI3K/AKT信号转导途径中的关键蛋白，在细胞的凋亡、存活、增殖等活动中发挥重要作用。AKT的激活与多种肿瘤的发生密切相关，在多种肿瘤组织中都有AKT的过度表达和活化。研究表明PAKT在NSCLC中的阳性率为41.2%，而在正常肺组织中的阳性率为0%〔6〕，Balsara等〔7〕对25例支气管癌前病变标本进行检测，表明化生/增生不良部位表现出AKT的活化，而正常和增生支气管上皮未检出活性AKT的表达。本结果显示不同性质的肺病变组织中PAKT蛋白的表达水平不同，在肺癌组织中有较高的阳性表达，与上述研究基本一致，提示AKT的活化可能在肺癌的发生中起重要作用，并可能成为一个新的肺癌诊断标志。

目前对活化AKT与肿瘤临床病理特征关系的研究报道不一〔8，9〕，我们的研究结果显示：肺癌组织中PAKT蛋白表达与患者的年龄、性别、吸烟、组织类型、TNM分期及淋巴结转移等无明显关系，而与肿瘤的分化程度明显相关，分化越差、恶性程度越高，PAKT蛋白的表达愈高。目前对AKT与肿瘤临床病理特征关系结论不一，有待于进一步扩大样本量及预后随访。

最近有研究表明〔10〕,AKT磷酸化以后可以激活一氧化氮合酶导致新生血管形成,促进VEGF诱导的内皮细胞迁移。在乳腺癌和前列腺癌细胞中AKT激活以后，可以通过HIF1α调节VEGF的表达。Slomiany〔11〕等在对头颈部鳞状细胞癌的研究中发现，在SCC9细胞中，IGFI可以通过PI3K/AKT/mTOR途径刺激VEGF的分泌及VEGF启动子的激活。Kobayashi〔10〕等研究表明经过AKT抑制剂LY294002处理的胃癌细胞VEGF蛋白的分泌明显下降,而在胃癌组织中，VEGF的高表达与PAKT有明显的相关性。但是未见对肺癌组织PAKT和血管生成关系的研究，因此我们检测了VEGF，以探讨AKT的活化是否与肺癌的血管生成相关，结果表明，肺癌组织中PAKT与VEGF的表达有明显的相关性。结合以上细胞和其他肿瘤组织中的研究结果及其机制,我们推测,在肺癌中可能存在AKT/VEGF通路，在肺癌中,AKT活化以后,一方面促进细胞的增殖,抑制细胞的调亡,增加细胞的运动能力;另一方面可以促进VEGF的表达和分泌，导致肿瘤新血管的生成，增加肿瘤的血供,从而为肺癌的发展和转移创造条件,两方面相互协调促进肺癌早期发生转移。而且AKT可能是众多因子调控VEGF表达通路中的关键蛋白,处于调节血管生成的中心环节，一氧化氮合酶、HIF1α、 IGFI等对VEGF的调节作用均与AKT活化密切相关,因而通过打断PI3K/AKT通路或者抑制AKT的活化有可能抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的侵袭和转移，可为肺癌的治疗提供新的方法。

【参考文献】

1 杨光华.病理学〔M〕.第5版.北京:人民卫生出版社,2001：85.

2 李晓明,汤钊蝤.内皮细胞生长因子及其受体与肿瘤血管形成〔J〕.国外医学·肿瘤学分册，1997;24(1):11.

3 Lababede O,Meziane MA,Rice TW,et al.TNM staging of lung cancer：a quick reference chart 〔J〕.Chest,1999;115(1):2335.

4 Tsurutani J,Fukuoka J，Tsurutani H，et al.Evaluation of Two phosphorylation sites Improve the prognostic significance of AKT Activation in nosmallcell lung cancer tumors〔J〕.J Clin Oncol,2006;24(2):30614.

5 Vlom M,Koomagi R,Mattren J，et al.Prognostic value of vascular endothelial growth and　its receptor　Fltlin squamous cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer,1997;74(1):648.

6 Tang JM，He QY，Guo RX,et al.Phosphorylated Akt overexpression and loss of PTEN expression in nonsmall cell lung cancer confers poor prognosis〔J〕.Lung Cancer，2006;51(2):18191.

7 Balsara BR，Pei J，Mitsuuchi Y，et al.Frequent activation of AKT in nonsmall cell lung carcinomas and preneoplastic bronchial lesions〔J〕. Carcinogenesis，2004;25(11):205369.

8 Tsao AS，McDonnell T，Lam S,et al.Increased phosphoAKT (Ser(473) expression in bronchial dysplasia：implications for lung cancer prevention studies〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2003;12(7):6604.

9 Shah A，Swain WA，Richardson D，et al.Phosphoakt expression is associated with a favorable outcome in nonsmall cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(8):29306.

10 Kobayashi I，Semba S，Matsuda Y,et al.Significance of Akt phosphorylation on tumor growth and vascular endothelial growth factor expression in human gastric carcinoma〔J〕.Pathobiology，2006;73(1):817.

11 Slomiany MG，Black LA，Kibbey MM,et al.IGF1 induced vascular endothelial growth factor secretion in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006;342(3):8518.