吉非替尼对肺腺癌细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响

作者                作者单位

王亚丽 山东大学附属山东省立医院呼吸科，山东 济南 250021

牟晓燕 山东大学附属山东省立医院呼吸科，山东 济南 250021

游力   山东大学附属山东省立医院呼吸科，山东 济南 250021

白小燕 山东大学附属山东省立医院呼吸科，山东 济南 250021

马春燕 山东大学附属山东省立医院呼吸科，山东 济南 250021

非小细胞肺癌(NSCLC)是西方国家肿瘤相关死亡的最主要原因,但目前化疗的疗效似乎达到平台,针对表皮生长因子受体(EGFR)的分子靶向治疗特异性强,在杀死肿瘤细胞的同时不杀死或极少杀伤正常细胞，是目前研究的热点〔1〕。EGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)中erbB家族(包括4个成员)之一，表面高表达。癌细胞表面。表皮生长因子酪氨酸激酶是NSCLC治疗药物的新靶位，通常表达于上皮来源的实体瘤〔2〕。吉非替尼作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂，用于晚期NSCLC的治疗〔3〕。研究发现〔4〕，在经治的晚期NSCLC患者中，吉非替尼治疗的有效率为15.2%～35.5%，疾病控制率为25.8%～50%,前景广阔，但对其作用的内在机制需要进一步研究。本文采用流式细胞仪、免疫荧光和实时荧光定量PCR技术探讨吉非替尼对肺腺癌A549细胞株增殖的抑制作用及其内在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人肺腺癌A549细胞株引种于山东大学附属省立医院中心实验室,二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司,吉非替尼(商品名IRESSA)由英国Astra Zeneca有限公司惠赠。EGFR兔抗人多克隆一抗购自武汉博士德公司，FITC标记羊抗兔IgG购自北京中杉公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix购自TAKARA公司，钙依赖性磷脂结合蛋白/碘化丙啶(Annexin V/PI)细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒购自晶美公司，Hoechst33258染液购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

人肺癌A549细胞株培养于含10%胎牛血清、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素的 RPMI1640培养基中,置37℃、5% CO2、100%湿度细胞培养箱,细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化传代，1 w传2～3次。实验用细胞为接种24 h后的对数生长期细胞。每次实验细胞分组如下：正常对照组;吉非替尼低剂量48 h组(5 μmol/L);吉非替尼低剂量72 h组(5 μmol/L);吉非替尼高剂量组72 h(25 μmol/L),均以RPMI1640培养液配置浓度。

1.2.2 药物配制和使用

吉非替尼用适量DMSO溶解，储存在-20℃，药物活性无改变，每次实验前用新鲜培养液配成相应工作浓度。所有实验中的DMSO终浓度均小于0.1%，根据Augustine Rauch等的研究成果,该浓度的DMSO对实验结果无显著影响〔5〕。

1.2.3 倒置相差显微镜下形态学观察

按上述方法分组加药后，倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态学改变。

1.2.4 细胞增殖及凋亡检测

取对数生长期细胞，每孔100 μl接种于96孔培养板中，每列的第一孔不加细胞，为调零孔。24 h后分别加入不同浓度的吉非替尼(0.5、1、10、25、50、100、150 μmol/L)、RPMI1640全培养液的空白对照,另设溶剂DMSO对照组，每组设置3个平行复孔。置 37℃、5%CO2的培养箱中培养24、48、72 h后，每孔加MTT 20 μl(5 mg/ml)，混匀，37 ℃孵育4 h;去除上清后，每孔加150 μl的DMSO，振摇10 min，酶标仪检测波长490 nm的每孔吸光度值(A值)求其平均值。据吸光度值计算细胞抑制率。抑制率(E):E=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%，以药物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制细胞生长抑制曲线。上述实验重复3次。AnnexinⅤ/PI双标与Hoechst33258染色法检测细胞凋亡。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期

细胞以5×105/ml接种24 h，分组加药，处理后收集细胞，PBS漂洗2次，按照细胞周期检测试剂盒说明书操作，最后上机检测，并用Multicycle for windows软件分析细胞周期分布的变化。

1.2.6 免疫荧光检测EGFR蛋白的表达

细胞接种在24孔板内盖片上，24 h后分组加药，继续孵育48 h后，用PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍。0.2%Triton X100通透20 min，PBS洗3遍。山羊血清封闭30 min，吸弃。EGFR一抗(1∶50)4℃湿盒内过夜，FITC标记二抗(1∶50)37℃避光孵育1.5 h，PBS洗3遍。甘油封片后照荧光片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测EGFR mRNA的表达

细胞细胞培养及处理方法同上，Trizol法提取待测细胞的总RNA，取500 ng总RNA反转录成cDNA，条件为37℃逆转录15 min,85℃ 5 s灭活逆转录酶。PCR引物由山东省立医院中心实验室游力老师设计，引物序列：EGFR上游：5′ACTGCCAGAAACTGACCAAAATC3′，下游：5′CCTGCAGCACACTGGTTGTG3′;内参引物GAPDH上游：5′CTGCTCCTCCTGTTCGACAGT3′，下游：5′CCGTTGACTCCGACCTTCAC3′。引物浓度0.2 μmol/L，SYBR Green Premix Ex TaqTM(2×) 10 μl，模板4 μl，整个反应体系20 μl，反应条件：预变性95℃ 2 min;PCR反应：95℃ 15 s，60℃ 1 min， 40个循环，并做融解曲线对PCR产物特异性进行鉴定。每个样本设置3个复孔，整个反应过程中荧光信号强度变化由7 500实时荧光PCR仪监测，电脑自动分析显示结果。

1.3 统计学分析

实验数据以x±s表示，用SPSS11.0软件进行t检验、χ2检验和方差分析。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下细胞形态学观察

正常对照组细胞紧密贴壁，边界清楚透明度高，生长旺盛，可见各期核分裂相。吉非替尼(5 μmol/L)干预48 h后可观察到贴壁细胞生长速度减慢，略变圆，形态改变，出现空泡和细小颗粒;72 h后胞内空泡和颗粒明显增多，细胞间隙增大。吉非替尼(25 μmol/L)72 h后细胞明显皱缩变圆脱落，颗粒增多开始碎解，见细胞碎片和凋亡小体，上述现象随时间的延长和剂量的增大逐渐明显，见图1。

2.2 吉非替尼对A549细胞活力的影响

MTT比色法检测结果显示：与正常对照组相比，干预组细胞抑制率(P<0.01)，而且不同吉非替尼剂量和不同作用时间差异有统计学意义(P<0.05)，表明吉非替尼对A549细胞的抑制作用呈时间和剂量依赖性，见图2。

2.3 吉非替尼对A549细胞凋亡的影响

AnnexinⅤ/PI双标法显示：正常对照组细胞凋亡率为(0.66 ±0.13)%,5 μmol/L 吉非替尼处理A549细胞48 h后，可见(6.00±1.27)%的细胞凋亡，72 h后细胞凋亡率高达(14.1±3.42)%，与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01)。而25 μmol/L吉非替尼干预72 h后凋亡率高达(34.1±5.66)%，明显高于正常对照组(P<0.01)和5 μmol/L吉非替尼干预72 h组(P<0.01)。为进一步验证此结果，采用Hoechst33258染色观察凋亡细胞数，正常细胞核染色均匀，形状规则，凋亡细胞核呈现核固缩浓染，核分叶呈月牙状或蚕豆状，碎裂呈米粒状。结果显示：正常对照组细胞凋亡率为(1.42±0.47)%，后吉非替尼(5 μmol/L)干预48、72 h组凋亡细胞数分别为(7.12±1.86)%和(16.3±2.17)%,而25 μmol/L吉非替尼干预72 h后细胞凋亡率高达(33.4±7.22)%，见图3。

2.4 吉非替尼对细胞周期的影响

正常对照组S期细胞比例(S%)为(58.9±5.2)%，G0/G1期比例(G0/G1%)为(11.2±2.2)%，G2期比例(G2%)为(29.9±2.9)%。5 μmol/L吉非替尼处理A549细胞48 h后，S%、G0/G1%、G2%依次为(37.4±1.6)%、(61.4±5.2)%、(29.9±2.9)%。与正常对照组相比，干预组S期细胞比例明显减少(P<0.01)，G0/G1期细胞比例明显增加(P<0.01)，提示吉非替尼主要引起G0～G1期阻滞。

2.5 免疫荧光检测EGFR蛋白表达结果

EGFR主要分布于细胞膜和细胞质，正常对照组平均荧光强度为178.65±3.12，可见在正常A549细胞中高表达;5 μmol/L吉非替尼处理A549细胞48 h后，EGFR平均荧光强度为102.45±6.72，相比正常对照组减弱(P<0.01)，72 h后平均荧光强度为96.36±8.43，明显低于正常对照组(P<0.01);而吉非替尼(25 μmol/L)作用72 h组表达极弱，平均荧光强度为33.64±5.24，与低剂量72 h(15 μmol/L)组相比差异显著(P<0.01)，见图4。

2.6 实时荧光定量PCR检测EGFR mRNA的表达结果

RTPCR结果显示：5 μmol/L吉非替尼处理48 h组、5 μmol/L吉非替尼处理72 h组、25 μmol/L吉非替尼组的EGFR mRNA的相对表达量分别为0.447±0.057、0.325±0.043、0.112±0.081，均低于正常对照组EGFR mRNA的相对表达量1,差异有显著性(P<0.01)。随着吉非替尼浓度的升高,A549细胞EGFR mRNA表达的相对量亦逐渐降低,低剂量处理48、72 h及高剂量处理72 h三组间两两比较差异均有显著性(P<0.05 )。荧光实时RTPCR过程中EGFR、GAPDH的熔解曲线为单一特异峰，无非特异产物，说明扩增准确、特异性好。

3 讨论

分子靶向治疗为肺癌的治疗提供了新的思路和希望，针对不同细胞表面分子的新型靶向药物不断涌现,其中作用于EGFR的靶向药物是较为重要的一类〔6〕。EGFR是一分子量为170 kD的跨膜糖蛋白,其胞外结构可与配体结合,胞内结构具有酪氨酸激酶活性，在肿瘤生长中的细胞增生、抑制凋亡、血管生成和转移扩散等方面发挥着重要作用〔7〕。研究发现，EGFR蛋白过度表达见于32%～79%的NSCLC患者，与疾病进展、生存期和化疗耐药有关〔8〕。吉非替尼是目前临床应用较广的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFRTKI)，与ATP竞争性地和EGFR的酪氨酸激酶胞内区位点结合,从而阻止细胞增殖,促进凋亡。来自两项IDEAL1/IDEAL2 及INTACT1/INTACT2国际多中心随机Ⅱ、Ⅲ期临床试验研究结果表明〔9〕：吉非替尼每日250 mg口服，二线治疗晚期NSCLC 有效率达到18.4%～27.5%，疾病控制率为42.2%～54.4%，症状改善率为40.3%～43.3%，同时发现初治患者、肿瘤EGFR突变以及具有其他与EGFR阻断敏感性相关的临床或肿瘤分子特征的患者缓解率更高，但对其作用的内在机制需要进一步研究。

免疫荧光结果显示,EGFR在A549细胞中呈过度表达,主要定位于细胞膜和细胞质，吉非替尼下调了EGFR蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的增殖、分化，可能是靶向作用的一个重要原因。在药物敏感性研究中,MTT法显示细胞的相对抑制率随着药物浓度提高及作用时间的延长而升高,说明A549细胞对吉非替尼敏感性较高，具有时间和剂量依赖性。AnnexinⅤ/PI双标和Hoechst33258染色法证实吉非替尼通过诱导细胞凋亡抑制A549细胞生长,且低浓度组与高浓度组之间存在显著差异(P<0.01)。有报道〔10〕,吉非替尼能够诱导头颈部肿瘤及恶性胸膜间皮瘤等多种恶性肿瘤 G1/S期细胞停滞。本实验流式细胞仪结果亦显示：在A549细胞中吉非替尼引起G0～G1期阻滞，与报道相一致。为了更加准确地判断胞内EGFR mRNA微量变化情况，本研究引入实时荧光定量RTPCR技术。结果显示：吉非替尼组的EGFR mRNA水平显著低于正常间对照组，且48和72 h处理组、5和25 μmol/L处理组相比差异均具有统计学意义。这再次说明，吉非替尼通过下调了EGFR的表达发挥重要的靶向治疗作用，且随着作用时间延长和浓度加大而增强。

【参考文献】

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10 Jalili A,Pinc A,Pieczkowski F，et al.Combination of an EGFR blocker and a COX2 inhibitor for the treatment of advanced cutaneous squamous cell carcinoma〔J〕.J Dtsch Dermatol Ges,2008;6(12):10669.