非小细胞肺癌中hMLH1启动子的甲基化
发表时间:2012-12-28 浏览次数:1053次
作者 作者单位
杨振华 210006,南京医科大学附属南京第一医院呼吸科
蔡映云 200032,复旦大学附属中山医院肺科
孙丽华 200032,复旦大学附属中山医院肺科
人类mut1同源物(Human mutl homolog 1,hMLH1)通过矫正错配变异的DNA恢复基因的正常功能而发挥抑癌基因的作用,hMLH1基因的变异将导致一系列恶性肿瘤的发病率上升。许多学者研究表明hMLH1在NSCLC中经常表达缺失,提示hMLH1在NSCLC发生发展中发挥重要作用。
本研究拟通过测定hMLH1在49例NSCLC中的甲基化状态与转录活性,探讨启动子甲基化与转录之间的关系,并观察去甲基化试剂5AzaCdR(5azadeoxycytidine,5杂糖胞苷)在体外干预的作用,探讨hMLH1在NSCLC中的作用。
1资料与方法
1.1研究对象
所有病例均为2003年3月~2003年9月在中山医院胸外科进行手术切除的NSCLC患者,癌旁标本为离肿瘤5cm远处的肺组织,标本获取后立即放置到-70℃低温冰箱中。49例NSCLC患者年龄在31~77岁,平均年龄为56±11岁,其中男34例,女15例,有吸烟史者30例,无吸烟史者19例,腺癌23例,鳞癌26例,临床分期按照1997年TNM分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,Ⅰ期18例、Ⅱ期16例、Ⅲ期15例。NSCLC细胞株购自中国科学院上海细胞所,分别为A549、SH77、SPCA1,37℃复苏、培养及传代。
1.2实验试剂
PCR的Faststart TaqDNA聚合酶购自Roche公司,T4连接酶、pGEMT载体购自Promega公司,测序试剂盒购自上海申能博彩公司;所有引物均由上海生工合成。hMLH1甲基化引物上游5′ ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC3′,下游5′ CCTCATCGTAACTACCCGCG3′,产物124bp;去甲基化引物上游5′TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT3′,下游5′ACCACCTCATCATAACTACCCACA3′,产物118bp;RT PCR的引物:hMLH1上游5′ GTGCTGGCAATCAGGGACCC3′,下游5′CACGGTTGAGGCATTGGGTAG3′,215bp;βactin上游5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′,下游5 TCAAGTTGGGGGACAAAAAG 3′,产物616bp。
1.3实验方法
1.3.1抽提组织DNA和RNA并反转cDNA
1.3.2基因组DNA的甲基化处理及MSP反应 每管加入2μl dNTP、2μl Buffer、15μl ddH2O、0.75UTaq酶混匀后加入甲基化/去甲基化引物各2μl和1μl DNA模板;预变性5min,进入35个循环:变性30s→退火30s→延伸30s,连接5min。电泳后割胶回收测序。
1.3.3RTPCR反应条件 94℃预变性5min,进入35个循环:变性60s→退火60s→延伸60s,在第13个循环加入βactin,最后连接5min。
1.3.4PCR产物回收测序 ① PCR产物的回收纯化:按照上海博彩公司的测序试剂盒进行PCR产物的回收测序。② 应用氯化钙法制备新鲜感受态细胞,构建PCR的重组体涂于氨苄青霉素抗性中培养,经PCR检测鉴定后阳性克隆送搏彩公司测序。
1.3.5取5×106个细胞在5% CO2、37℃的RPMI1640培养液(含100U/ml青霉素 +100μg/ml链霉素)中培养24h后加入5AzaCdR 2μg/ml,2天更换一次培养液,共育8d后收割细胞,提取RNA后测定转录水平。
1.4统计方法
采用SPSS10.0统计软件,甲基化率的比较采用χ2分析,P<0.05有统计学差异。
2结果
2.1hMLH1甲基化与NSCLC患者年龄、吸烟史、病理类型及TNM临床分期的关系
hMLH1在NSCLC癌组织中的甲基化率55%(27/49)明显高于癌旁组织14%(7/49)(P<0.001);hMLH1甲基化率>65岁组93.3%(14/15)明显高于≤65岁组38%(13/34) (P<0.001);hMLH1的甲基化率在吸烟指数>400年支组100%(14/14)高于吸烟指数≤400年支组56%(9/16)(P=0.006),而后者高于无吸烟史组21%(4/19)(P=0.036);腺癌的甲基化率48%(11/23)而鳞癌为62%(16/26),两者比较无差异(P=0.250);临床Ⅲ期的甲基化率100%(15/15)高于 I 期56%(9/16)(P=0.004), I 期的甲基化率高于Ⅱ期17%(3/18)(P=0.019)。
2.2hMLH1基因MSP电泳条带测序
目的条带测序结果证实了甲基化的胞嘧啶(C)由于甲基(CH3)的保护在亚硫酸处理后无变化,而去甲基化的C则转变为胸腺嘧啶(T),证实本实验所应用的MSP获得的PCR产物是可靠的,见图1。
2.3NSCLC癌组织hMLH1甲基化与mRNA转录之间的关系
在49例NSCLC癌组织标本中有37例转录失活或与癌旁组织相比转录水平下降,比例高达75.51%,其中27例存在启动子甲基化,占61.76%,见图2。
2.4NSCLC细胞株hMLH1甲基化状态及5AzaCdR的干预作用
3例细胞株甲基化的状态为:A549和SPCA1为甲基化而SH77为去甲基化状态;A549、SPCA1 mRNA均不转录,经5AzaCdR处理后恢复转录,而SH77经5AzaCdR处理前后均存在转录水平无变化,见图3。
3讨论
目前认为基因启动子CpG岛甲基化是导致基因特别是抑癌基因失活的重要原因,启动子甲基化在NSCLC发生发展中的重要作用正受到越来越多的重视。
hMLH1在癌组织中的甲基化率明显高于癌旁组织,说明hMLH1启动子甲基化具有肿瘤特异性。DNA的甲基化在哺乳动物体细胞发育过程中也发挥正常的生理调节作用,研究表明某些基因的甲基化水平随着年龄增长而升高 [1],本研究也发现hMLH1启动子甲基化发生率在≥65岁年龄组高于<65岁组。
烟草与肺癌尤其是鳞癌发生的关系密切,烟草中的致癌物质是否直接导致基因发生甲基化目前尚无定论,但动物实验表明烟草中的致癌物可以诱导小鼠体内某些基因如DAPK、RASSF1a等发生甲基化 [2]。本研究证实在NSCLC中hMLH1基因的甲基化率与吸烟指数密切相关,提示烟草具有潜在的诱导hMLH1发生甲基化,与 Hsu等[3]的研究结论一致。
临床TNM分期决定了NSCLC的预后和肺癌的进展状况,基因的甲基化是否与TNM分期有关?本研究证实hMLH1的甲基化水平随着临床TNM分期的进展而逐渐增加,提示hMLH1的甲基化与NSCLC的局部侵犯、淋巴转移及远处转移密切相关,说明基因的甲基化是一个肺癌发生的早期分子信号,并与肺癌的局部侵袭、淋巴转移及远处转移有关,国外学者的研究也表明hMLH1的甲基化可能提示肺癌患者的预后较差[3]。
导致基因转录失活的机制包括点突变、纯合删除以及胞嘧啶核苷酸的异常甲基化,而启动子甲基化在基因转录中的调节作用受到越来越多的重视。目前认为基因启动子区域发生甲基化后,DNA的双螺旋结构变得更加紧密而影响解链过程,从而抑制基因的转录过程[4]。Wang等[5]人发现NSCLC甲基化率达55.8%,并与该基因mRNA的转录水平密切相关,这与本研究结论一致,由此推断启动子甲基化是调节hMLH1转录的重要机制。
5AzaCdR是一潜在的去甲基化剂并且具有抑制细胞分化的作用,许多学者都证实5AzaCdR在体外具有逆转基因的甲基化而恢复mRNA的转录水平[6]。本研究证实,5AzaCdR具有逆转hMLH甲基化恢复其转录活性的作用,提示5AzaCdR可能成为潜在的NSCLC基因治疗的试剂。
总之,hMLH1启动子甲基化与NSCLC的病理生理密切相关,并且启动子甲基化是调节其转录的重要机制,在细胞株水平5AzaCdR可以逆转hMLH1的转录活性,本研究为进一步阐明NSCLC的发生机制及NSCLC的基因诊断和治疗奠定理论基础。
【参考文献】
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