非小细胞肺癌中hMLH1启动子的甲基化

作者                     作者单位

杨振华  210006,南京医科大学附属南京第一医院呼吸科

蔡映云  200032,复旦大学附属中山医院肺科

孙丽华  200032,复旦大学附属中山医院肺科

人类mut1同源物(Human mutl homolog 1,hMLH1)通过矫正错配变异的DNA恢复基因的正常功能而发挥抑癌基因的作用,hMLH1基因的变异将导致一系列恶性肿瘤的发病率上升。许多学者研究表明hMLH1在NSCLC中经常表达缺失，提示hMLH1在NSCLC发生发展中发挥重要作用。

本研究拟通过测定hMLH1在49例NSCLC中的甲基化状态与转录活性，探讨启动子甲基化与转录之间的关系，并观察去甲基化试剂5AzaCdR(5azadeoxycytidine，5杂糖胞苷)在体外干预的作用，探讨hMLH1在NSCLC中的作用。

1资料与方法

1.1研究对象

所有病例均为2003年3月～2003年9月在中山医院胸外科进行手术切除的NSCLC患者，癌旁标本为离肿瘤5cm远处的肺组织，标本获取后立即放置到-70℃低温冰箱中。49例NSCLC患者年龄在31～77岁，平均年龄为56±11岁，其中男34例，女15例，有吸烟史者30例，无吸烟史者19例，腺癌23例，鳞癌26例，临床分期按照1997年TNM分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，Ⅰ期18例、Ⅱ期16例、Ⅲ期15例。NSCLC细胞株购自中国科学院上海细胞所，分别为A549、SH77、SPCA1，37℃复苏、培养及传代。

1.2实验试剂

PCR的Faststart TaqDNA聚合酶购自Roche公司，T4连接酶、pGEMT载体购自Promega公司，测序试剂盒购自上海申能博彩公司;所有引物均由上海生工合成。hMLH1甲基化引物上游5′ ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC3′，下游5′ CCTCATCGTAACTACCCGCG3′，产物124bp;去甲基化引物上游5′TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT3′,下游5′ACCACCTCATCATAACTACCCACA3′,产物118bp;RT PCR的引物：hMLH1上游5′ GTGCTGGCAATCAGGGACCC3′,下游5′CACGGTTGAGGCATTGGGTAG3′,215bp;βactin上游5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′,下游5 TCAAGTTGGGGGACAAAAAG 3′，产物616bp。

1.3实验方法

1.3.1抽提组织DNA和RNA并反转cDNA

1.3.2基因组DNA的甲基化处理及MSP反应 每管加入2μl dNTP、2μl Buffer、15μl ddH2O、0.75UTaq酶混匀后加入甲基化/去甲基化引物各2μl和1μl DNA模板;预变性5min，进入35个循环：变性30s→退火30s→延伸30s，连接5min。电泳后割胶回收测序。

1.3.3RTPCR反应条件 94℃预变性5min，进入35个循环：变性60s→退火60s→延伸60s，在第13个循环加入βactin，最后连接5min。

1.3.4PCR产物回收测序 ① PCR产物的回收纯化:按照上海博彩公司的测序试剂盒进行PCR产物的回收测序。② 应用氯化钙法制备新鲜感受态细胞，构建PCR的重组体涂于氨苄青霉素抗性中培养，经PCR检测鉴定后阳性克隆送搏彩公司测序。

1.3.5取5×106个细胞在5% CO2、37℃的RPMI1640培养液(含100U/ml青霉素 +100μg/ml链霉素)中培养24h后加入5AzaCdR 2μg/ml，2天更换一次培养液，共育8d后收割细胞，提取RNA后测定转录水平。

1.4统计方法

采用SPSS10.0统计软件，甲基化率的比较采用χ2分析，P<0.05有统计学差异。

2结果

2.1hMLH1甲基化与NSCLC患者年龄、吸烟史、病理类型及TNM临床分期的关系

hMLH1在NSCLC癌组织中的甲基化率55%(27/49)明显高于癌旁组织14%(7/49)(P<0.001);hMLH1甲基化率>65岁组93.3%(14/15)明显高于≤65岁组38%(13/34) (P<0.001);hMLH1的甲基化率在吸烟指数>400年支组100%(14/14)高于吸烟指数≤400年支组56%(9/16)(P=0.006)，而后者高于无吸烟史组21%(4/19)(P=0.036);腺癌的甲基化率48%(11/23)而鳞癌为62%(16/26)，两者比较无差异(P=0.250);临床Ⅲ期的甲基化率100%(15/15)高于 I 期56%(9/16)(P=0.004)， I 期的甲基化率高于Ⅱ期17%(3/18)(P=0.019)。

2.2hMLH1基因MSP电泳条带测序

目的条带测序结果证实了甲基化的胞嘧啶(C)由于甲基(CH3)的保护在亚硫酸处理后无变化，而去甲基化的C则转变为胸腺嘧啶(T)，证实本实验所应用的MSP获得的PCR产物是可靠的，见图1。

2.3NSCLC癌组织hMLH1甲基化与mRNA转录之间的关系

在49例NSCLC癌组织标本中有37例转录失活或与癌旁组织相比转录水平下降，比例高达75.51%，其中27例存在启动子甲基化，占61.76%，见图2。

2.4NSCLC细胞株hMLH1甲基化状态及5AzaCdR的干预作用

3例细胞株甲基化的状态为：A549和SPCA1为甲基化而SH77为去甲基化状态;A549、SPCA1 mRNA均不转录，经5AzaCdR处理后恢复转录，而SH77经5AzaCdR处理前后均存在转录水平无变化，见图3。

3讨论

目前认为基因启动子CpG岛甲基化是导致基因特别是抑癌基因失活的重要原因，启动子甲基化在NSCLC发生发展中的重要作用正受到越来越多的重视。

hMLH1在癌组织中的甲基化率明显高于癌旁组织，说明hMLH1启动子甲基化具有肿瘤特异性。DNA的甲基化在哺乳动物体细胞发育过程中也发挥正常的生理调节作用，研究表明某些基因的甲基化水平随着年龄增长而升高 [1]，本研究也发现hMLH1启动子甲基化发生率在≥65岁年龄组高于<65岁组。

烟草与肺癌尤其是鳞癌发生的关系密切，烟草中的致癌物质是否直接导致基因发生甲基化目前尚无定论，但动物实验表明烟草中的致癌物可以诱导小鼠体内某些基因如DAPK、RASSF1a等发生甲基化 [2]。本研究证实在NSCLC中hMLH1基因的甲基化率与吸烟指数密切相关，提示烟草具有潜在的诱导hMLH1发生甲基化，与 Hsu等[3]的研究结论一致。

临床TNM分期决定了NSCLC的预后和肺癌的进展状况，基因的甲基化是否与TNM分期有关?本研究证实hMLH1的甲基化水平随着临床TNM分期的进展而逐渐增加，提示hMLH1的甲基化与NSCLC的局部侵犯、淋巴转移及远处转移密切相关，说明基因的甲基化是一个肺癌发生的早期分子信号，并与肺癌的局部侵袭、淋巴转移及远处转移有关，国外学者的研究也表明hMLH1的甲基化可能提示肺癌患者的预后较差[3]。

导致基因转录失活的机制包括点突变、纯合删除以及胞嘧啶核苷酸的异常甲基化，而启动子甲基化在基因转录中的调节作用受到越来越多的重视。目前认为基因启动子区域发生甲基化后，DNA的双螺旋结构变得更加紧密而影响解链过程，从而抑制基因的转录过程[4]。Wang等[5]人发现NSCLC甲基化率达55.8%，并与该基因mRNA的转录水平密切相关，这与本研究结论一致，由此推断启动子甲基化是调节hMLH1转录的重要机制。

5AzaCdR是一潜在的去甲基化剂并且具有抑制细胞分化的作用，许多学者都证实5AzaCdR在体外具有逆转基因的甲基化而恢复mRNA的转录水平[6]。本研究证实，5AzaCdR具有逆转hMLH甲基化恢复其转录活性的作用，提示5AzaCdR可能成为潜在的NSCLC基因治疗的试剂。

总之,hMLH1启动子甲基化与NSCLC的病理生理密切相关，并且启动子甲基化是调节其转录的重要机制，在细胞株水平5AzaCdR可以逆转hMLH1的转录活性，本研究为进一步阐明NSCLC的发生机制及NSCLC的基因诊断和治疗奠定理论基础。

【参考文献】

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\[2\]Pulling LC,Vuillemenot BR,Hutt JA,et al.Aberrant promoter hypermethylation of the deathassociated protein kinase gene is early and frequent in murine lung tumors induced by cigarette smoke and tobacco carcinogens\[J\].Cancer Res,2004,64(11):38443848.

\[3\]Hsu HS,Wen CK,Tang YA,et al.Promoter hypermethylation is the predominant mechanism in hMLH1 and hMSH2 deregulation and is a poor prognostic factor in nonsmoking lung cancer\[J\].Clin Cancer Res,2005,11(15):54105416.

\[4\]Burgers WA,Fuks F,Kouzarides T.DNA methytransfase get connected to chromatin\[J\].Trends Genet,2002,18(6):275277.

\[5\]Wang YC,Lu YP,Tseng RC,et al.Inactivation of hMLH1 and hMSH2 by promoter methylation in primary nonsmall cell lung tumors and matched sputum samples\[J\].Clin Invest,2003,111(6):887895.

\[6\]Bovenzi V,Momparler RL.Antineoplastic action of 5aza2′deoxycytidine and histone deacetylase inhibitor and their effect on the expression of retinoic acid receptor beta and estrogen receptor alpha genes in breast carcinoma cells\[J\].Cancer Chemother Pharmacol,2001,8(1):7176.