IGF-I、IGF-IR在人退行性变腰椎间盘中的表达及其生物学意义

作者              作者单位

谢洋   东南大学临床医学院，江苏 南京 21000

吴小涛 东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009)

Expression and biological significance of IGFI and IGFIR

in human degenerative intervertebral discs

XIE Yang1, WU Xiaotao2(1. School of Clinical Medicine, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Orthopaedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

[Abstract] Objective: To observe the expression of IGFI and IGFIR in human degenerative intervertebral discs and to investigate its biological significance. Methods: 69 patients were divided into two groups: 16 cases of normal intervertebral discs in group A and 53 cases of degenerative intervertebral discs in group B. The expression of IGFI，IGFR, PCNA and apoptosis were detected by immunohistochemistry and TUNEL. Results: The expression rates of IGFI and IGFIR in group B was lower than those in group A, the difference was significant between them(P<0.05). Proliferative index(PI) in group B was lower than that in group A, the difference was significant between them(P<0.05). Apoptotic index(AI) in group B was significant higher than that in group A(P<0.05). The expression of IGFI，IGFIR had positive correlation with PI(rs=0.59, rs=0.56, all P<0.01) and negative correlation with AI(rs=0.60, rs=0.57, all P<0.01). There was significant difference in PI and AI between IGFI, IGFIR positive expression group and negative expression group(P<0.05). Conclusion: Abnormal expression of IGFI，IGFIR is closely related to degenerative intervertebral discs; IGFI and IGFIR promote cell proliferation and inhibit intervertebral discs cell apoptosis, which has an important effect on the degeneration of intervertebral discs. Abnormal expression of IGFI,IGFIR can induce degeneration of intervertebral discs.

[Key words] insulinlike growth factorI; insulinlike growth factorI receptor; intervertebral disc degeneration

椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration，IDD)在成人中有较高的发生率，传统的观点认为IDD与过度的身体负荷引起的损伤有关。有研究显示IDD的主要机理可能是椎间盘细胞衰老、凋亡。椎间盘活性细胞减少及随之而来的细胞外基质合成减少和成分改变，是导致IDD的病理学基础，而椎间盘细胞过度凋亡是导致椎间盘细胞减少的直接原因[1]。胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor ，IGF)与椎间盘细胞外基质变化和椎间盘细胞增殖、凋亡密切相关[2]。IGFI及其受体(IGFIR)，作为IGF家族重要成员与结合蛋白和结合蛋白酶共同构成IGF轴，它们在促进细胞生长、有丝分裂及抗凋亡方面具有十分重要的作用[3]。本研究通过免疫组化SP法检测IGFI、IGFIR、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在人退行性变腰椎间盘组织中的表达，TUNEL法检测椎间盘细胞凋亡情况，探讨IGFI、IGFIR在人椎间盘退行性变中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2008年7月至2009年9月东南大学附属马鞍山市人民医院病理科腰椎间盘组织存档蜡块69例。其中16例为没有腰痛病史、影像学及病理学证实椎间盘没有退行性变、椎体爆裂性骨折患者的椎间盘组织，作为正常对照组(A组)，包括男10例，女6例，年龄20～40岁,平均(28.2±6.2)岁。余53例均为术前经CT或(和)MRI诊断为腰椎间盘突出症、术后病理学检查证实为退行性变腰的椎间盘组织，作为退变椎间盘组(B组)，包括男26例，女27例，年龄33～71岁,平均(48.6±10.5)岁。所有患者均未行硬膜外封闭、化学溶核、经皮穿刺髓核切吸术、放化疗及免疫治疗。所有手术均采用腰椎后路标准术式，同法获取椎间盘组织。

1.2 试剂

兔抗人IGFI、IGFIR多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人PCNA多克隆抗体，SP、TUNEL检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 方法

石蜡标本，4 μm厚连续切片分别用于免疫组化(SP)法及TUNEL检测，具体步骤见试剂盒说明书。以PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。IGFIR为细胞膜受体，在细胞内生成，变构后转移至膜上，细胞浆内、细胞膜上均有表达。IGFI则主要在细胞浆内表达。如试剂说明书所示，显微镜下，IGFIR阳性着色主要位于细胞浆、细胞膜，IGFI阳性着色主要位于细胞浆，均以出现棕黄色颗粒判定为阳性细胞。高倍镜下(×400)随机观察5个视野，以阳性细胞百分率和染色强度为判定标准，阳性细胞≤30%为阴性(-)，31%～50%为弱阳性(+)，51%～80%为阳性(++)，≥81%为强阳性(+++)[4]。细胞增殖指数(proliferative index，PI)以平均每100个细胞中PCNA阳性细胞数来判断。TUNEL法检测细胞凋亡，以凋亡指数(apoptotie index，AI)即平均每100个细胞中凋亡细胞数来判断结果。

1.4 统计学处理

应用SPSS 12.0统计软件进行数据处理，采用χ2检验、t检验及Spearman相关分析法进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组中IGFI、IGFIR阳性表达率及PI和AI

IGFIR阳性着色主要位于细胞浆、细胞膜，IGFI阳性着色主要位于细胞浆。A组IGFI、IGFIR表达率分别为75.00%、68.75%，高于B组(47.17%、39.62%)，两组比较有显著差异(P<0.05)(表1，图1～4)。B组PI低于A组，两组比较有显著差异(P<0.05);B组AI高于A组，两组比较有显著差异(P<0.05)(表1，图5～8)。表1 两组IGFI、IGFIR的阳性表达率及PI和AIA组IGFI阳性12例，阴性4例;B组IGFI阳性25例，阴性28例。IGFI在两组椎间盘中的表达与PI值呈正相关(rs=0.59,P<0.01)。A组IGFIR阳性11例，阴性5例;B组IGFIR阳性21例，阴性32例。IGFIR在两组椎间盘中的表达与PI值呈正相关(rs=0.56，P<0.01)。IGFI、IGFIR阳性椎间盘与阴性椎间盘比较，PI值差异显著(P<0.05)，见表2。表2 IGFI、IGFIR的表达与PI的关系与IGFI阳性比较,a P<0.05;与IGFIR阳性比较,b P<0.052.3 IGFI、IGFIR的表达与AI的关系

IGFI在两组椎间盘中的表达与AI值呈负相关(rs=-0.60,P<0.01),IGFIR在两组椎间盘中的表达与AI值呈负相关(rs=-0.57，P<0.01)。IGFI、IGFIR阳性椎间盘与阴性椎间盘比较，AI值有显著差异(P<0.05)，见表3。表3 IGFI、IGFIR的表达与AI的关系

3 讨 论

椎间盘细胞凋亡与增殖一样都是机体自然的生理过程，两者并存，且保持动态平衡。如果椎间盘细胞生长因子缺乏，凋亡过多，不能有效调节生长发育，这种平衡破坏，就会导致IDD[5]。有研究表明，IGFI能刺激软骨细胞增殖，并可延缓及阻止多种体细胞的凋亡[6]。IGFI是一种低分子量、具有合成代谢、生长促进和胰岛素样作用的多肽，在体外培养条件下与IGFIR结合具有维持细胞表型，促进细胞外基质合成、抑制凋亡和促进细胞增殖的作用。目前细胞培养与动物实验研究均表明IGFI促进细胞增殖生长的活性主要由IGFIR介导，IGFI、IGFIR的表达下调与IDD密切相关[7]。王磊等[8]发现，在人退变椎间盘细胞培养液中加入IGFI能使其合成Ⅱ型胶原的能力显著提高。本实验研究结果显示，正常及退变人体椎间盘组织中均存在IGFI、IGFIR的表达，但B组(47.17%、39.62%)明显低于A组(75.00%、68.75%)，两组比较有显著差异(P<0.05)。提示IGFI、IGFIR的异常表达与人腰IDD密切相关，并在人IDD过程中起着重要作用。本次实验所选取正常对照组为年轻外伤后手术椎间盘组织，至于年龄及外伤引起的炎症反应是否对实验结果有所影响，有待今后进一步研究。

IGFI、IGFIR的主要功能为促进细胞增殖及细胞外基质的合成。PI是评价细胞增殖活性的主要参数，现已作为一项评估细胞增殖状态的指标广泛用于各项研究。Osada等[9]证实了牛髓核细胞有IGFI mRNA的表达和IGFIR的存在，IGFI通过自分泌或旁分泌的方式发生作用，外源性IGFI可促进牛髓核细胞蛋白聚糖的合成。本研究结果显示，B组PI值低于A组，两组比较有显著差异(P<0.05)。本研究结果还显示，人体椎间盘组织IGFI、IGFIR阳性组PI值明显高于IGFI、IGFIR阴性组，两组比较有显著差异(P<0.05)，并且IGFI、IGFIR阳性率与PI值呈正相关。提示IGFI、IGFIR低表达可能通过抑制细胞增殖促进了椎间盘退行性变的发生。

IDD的发生与细胞凋亡的紊乱有关[10]，IGFI及其受体是抗凋亡信号的主要调节者。Gruber等[11]在1%血清中培养纤维环细胞，引起明显凋亡，然后在培养液中加入50～500 ng·ml-1 IGFI，椎间盘细胞凋亡的比例明显降低，体外培养椎间盘细胞中IGFI具有明显的抗细胞凋亡作用，从而保持活细胞的数量。本研究结果显示，B组AI值高于A组，两组比较有显著差异(P<0.05)。本研究结果还显示，人体椎间盘组织IGFI、IGFIR阳性组AI值明显低于IGFI、IGFIR阴性组，两组比较有显著差异(P<0.05)，并且IGFI、IGFIR阳性率与AI值呈负相关。提示IGFI、IGFIR低表达可能通过促进细胞凋亡导致了IDD的发生。

综上所述，IGFI、IGFIR的异常表达与人IDD密切相关;IGFI、IGFIR具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，其异常表达可能导致IDD的发生。IGFI、IGFIR有望作为检测IDD及分子生物学治疗的指标，值得临床进一步探讨。

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