结直肠癌免疫细胞浸润与趋化因子单核细胞趋化蛋白-1表达的关系

作者                     作者单位

杨春康  福建医科大学 附属第一医院肿瘤外科,福州 350005　

陈道达  华中科技大学 同济医学院协和医院普外科，武汉 430022

应敏刚  福建省肿瘤医院 腹部外科,福州 350014

人们早已认识到肿瘤组织中存在免疫细胞的浸润[1]，但它们在肿瘤中聚积的机理及其分子基础目前仍不十分清楚。趋化因子因其能选择性地引导白细胞亚群的定向游走和组织内聚集而倍受关注。本课题组已证实结直肠癌细胞能表达并产生趋化因子[23]，本研究拟探讨趋化因子单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein1,MCP1)与浸润的免疫细胞之间的关系，以期进一步揭示趋化因子的生物学作用及其临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 40例标本均来自福建医科大学附属第一医院，男性27例，女性13例;年龄(56±12)岁(35～70岁);直肠癌24例，结肠癌16例，其中有淋巴结或远处转移者22例。高分化腺癌19例，中分化腺癌14例，低分化腺癌7例。Dukes’A期5例，Dukes’B期14例，Dukes’C期15例，Dukes’D期6例。

术中取新鲜结直肠癌组织，置-80 ℃液氮中保存，40例新鲜保存标本冰冻切片检测MCP1后剩余标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋待行免疫细胞检测。收集同一患者距肿瘤边缘>15 cm相应的正常结直肠组织为对照组。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 抗MCP1抗体(美国Santa Cruz公司);免疫细胞抗体(福州迈新生物试剂公司)包括：抗CD3单抗(识别总T细胞);抗CD4单抗(识别辅助性T细胞);抗CD8单抗(识别细胞毒性T细胞);抗CD20单抗(识别B细胞);抗CD57单抗(识别NK细胞);抗CD68单抗(识别巨噬细胞)。

1.2.2 免疫组织化学检测 将新鲜保存的40例结直肠癌组织标本及其正常组织行冰冻切片，切片厚度约6 μm。采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒检测MCP1蛋白的表达情况。具体方法按常规操作，一抗MCP1的浓度1∶50，室温下孵育60 min。MCP1检测后剩余标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，进行免疫组织化学检测浸润的免疫细胞。显色系统采用DAB溶液。

1.2.3 结果判定 光学显微镜下，根据MCP1染色反应的强度，按其阳性细胞的数量评分及染色深度分别记为0～3分，其中阳性细胞数<50%为1分，50%～80%为2分，>80%为3分，染色深度以多数细胞的呈色反应为准，并根据每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘的得分为其最低积分，积分分为四种，即阴性(一)为0～1分;弱阳性(+)为2分，阳性()为3～4分，强阳性()为5～6分。

1.2.4 免疫细胞计数方法 在400倍高倍镜视野下，随机选择5个视野，其中位于肿瘤内2个，位于肿瘤边缘3个，且带有肿瘤基底部基质。将着色呈红色(NK细胞AEC染色)或棕色(DAB染色)、形状类似免疫细胞的细胞被计数在内。每个视野肿瘤细胞及阳性细胞均被计数，计算出每100个肿瘤细胞含阳性细胞的百分数。<20%记为“+”，“20%～50%”记为“”，>50%记为“”，以上结果计数由2个病理医师共同完成。

1.3 统计学处理 采用SPSS统计软件包处理数字统计，MCP1表达与浸润细胞之间的关系采用χ2检验。

2 结果

2.1 结直肠癌组织MCP1蛋白的表达 MCP1表达的阳性率为36/40(90%)，着色部位位于肿瘤细胞质中，着色深浅不一。正常结直肠黏膜组织也出现MCP1的弱阳性表达，且多集中于绒毛的表层。MCP1蛋白的表达与结直肠癌的转移呈负相关(χ2=8.732，P=0.033)，表达强者，转移发生率低(表1)。Spearman’s检验(Spearmans’=-0.461，P=0.003),表明MCP1的表达还与结直癌Dukes’分期有关，表达强者，分期较早(表2)。但与结直肠癌肿瘤位置、分化及年龄无关(P>0.05)。

表1 结直肠癌MCP1的表达与肿瘤转移的关系(略)

Tab 1 The expression of MCP1 in colorectal cancer and its relationship to metastasis

表中数据为例数.

表2 MCP1蛋白表达与结直肠癌Dukes’分期的关系(略)

Tab 2 The expression of MCP1 in colorectal cancer and its relationship to Dukes’stageDukes’

表中数据为例数.

2.2 结直肠癌组织中浸润免疫细胞的分布 浸润细胞数量以CD68+的巨噬细胞为最多，其次是CD3+、CD8+、和CD4+的T细胞，而B细胞和NK细胞相对较少(图1～6)。免疫细胞位置的分布，多集中于肿瘤间质中或淋巴滤泡中，而肿瘤巢内则相对较少。

2.3 免疫细胞浸润与结直肠癌转移的关系 巨噬细胞、CD3+T细胞、CD4+的T细胞和CD8+的T细胞的浸润，均与结直肠癌的转移有关(P<0.05)，浸润多者，转移发生率低。而B细胞浸润与结直肠癌的转移无关(P>0.05，表3)。

2.4 MCP1表达与浸润免疫细胞之间的关系 结直肠癌MCP1的表达与浸润的巨噬细胞有关(P<0.05)，表达强者巨噬细胞浸润数量增多。MCP1表达与浸润的CD3+、CD4+、CD8+的T细胞均有关(P<0.05)，表达强者，T细胞浸润数量则增多;与NK细胞的浸润有关(P<0.05)，表达强者，NK细胞浸润数量则增多;但MCP1的表达与B细胞的浸润无关(P>0.05，表4)。

表3 免疫细胞的浸润与结直肠癌转移的关系(略)

Tab 3 Infiltration of immunocyte in colorectal cancer and its relationship to metastasisn

表中数据为例数.

3 讨论

趋化因子是一类小分子生物活性肽家族，在肿瘤的浸润和转移中起重要作用[4]。本研究显示MCP1的表达与结直肠癌转移及Dukes’分期有关。MCP1表达强者，其转移发生率低而分期也较早。这种结果可能与MCP1有强烈趋化巨噬细胞的作用有关，巨噬细胞浸润肿瘤部位后，能产生许多调控因子、酶、氧化代谢物等并发挥吞噬作用，从而影响肿瘤的生长。MCP1最早是从人胶质瘤细胞株V105的培养上清中钝化和鉴别出来的，具有吸引单核细胞，巨噬细胞和NK细胞的功能，但不具有吸引中性粒细胞或淋巴细胞的功能，它同源于鼠JE基因，MCP1在趋化因子家族中属于CC家族，其编码因位于人第17号染色体上[5]。本研究显示，结直肠癌MCP1的表达与巨噬细胞、CD3+、CD4+、CD8+ T细胞及NK细胞的浸润有关，MCP1表达强者，这些细胞的浸润则多。表明MCP1的存在是免疫细胞聚集的重要因素，但MCP1的表达与B细胞的浸润无明显关系。既往在体内体外的研究显示MCP1能趋化巨噬细胞、T细胞及NK细胞等[6]，本研究结果与此一致，免疫细胞的这种定向移动显然与局部的趋化因子有关。目前认为特定的趋化因子能与免疫细胞表面相应的趋化因子受体结合，引导特定免疫细胞的定向移动。

表4 结直肠癌MCP1表达与免疫细胞浸润的关系(略)

Tab 4 The expression of MCP1 in colorectal cancer and its relationship to the infiltration of immunocyte

表中数据为例数.

本研究显示，结直肠癌组织中浸润的免疫细胞主要是巨噬细胞和T淋巴细胞，其它细胞如NK细胞、B细胞等则相对较少。其中多数免疫细胞如CD3+、CD4+、CD8+的T细胞，NK细胞，B细胞等多位于肿瘤间质中，而巨噬细胞除位于肿瘤间质外，在肿瘤巢内也存在较多量的浸润。这些结果与Horney等的研究一致[7]。肿瘤组织中免疫细胞的浸润是机体的一种肿瘤免疫反应，这种反应属于细胞免疫范畴。本研究结果显示机体在结直肠癌肿瘤免疫中起主要作用的是巨噬细胞和T细胞;结果还显示，免疫细胞如巨噬细胞，CD3+、CD4+、CD8+T细胞及NK细胞的浸润与结直肠癌的转移有关，这些细胞浸润多者，结直肠癌的转移发生率则较低，表明这些细胞对结直肠癌的发展均有一定的抑制作用。Funada等研究认为结直肠癌CD8+的T细胞浸润与其预后有关;Clarke的研究也认为CD4+的T细胞浸润能抑制肿瘤的生长，可应用于肿瘤的免疫治疗[89]。巨噬细胞存在双向作用，既有抗肿瘤作用，也有促肿瘤作用，何种作用起主导，主要取决于巨噬细胞活化的状态及肿瘤细胞内在的特性[10]。关于NK细胞，较早就有人认为NK细胞能抑制肿瘤细胞的生长及转移[11]，这些研究均说明机体自身免疫机制在肿瘤的生长、发展中起重要的作用。其抗肿瘤机制依免疫细胞的不同，肿瘤的不同及机体状况的不同而起不同的作用[12]。如CD4+的T细胞多为辅助性T细胞，它们对抗体生成，巨噬细胞活化及T淋巴细胞的活化有辅助、放大效应，并通过它们发挥作用。CD8+的T细胞则可直接杀伤带有致敏抗原肽MHC分子的肿瘤细胞。通过与靶细胞结合，致死性打击及诱导靶细胞坏死或凋亡而起到抗肿瘤作用。巨噬细胞则通过抗原提呈作用;产生TNFα;合成和释放一氧化氮;直接杀伤肿瘤细胞或ADCC作用以及单核因子的免疫调节作用等而发挥抗肿瘤作用。至于NK细胞则不经致敏即可直接杀伤敏感的肿瘤细胞。虽然本研究没有得出B细胞的浸润与结直肠癌的转移有关。这可能与本组研究的样本数还不够多有关。但B细胞是机体参与抗肿瘤体液免疫的重要因素，它通过B细胞的活化、分化成浆细胞分泌抗体而参与机体的抗肿瘤免疫。趋化因子这种趋化免疫细胞的活性，在肿瘤的免疫治疗中受到重视，但由于免疫细胞及细胞因子作用的双重性，将这些结果应用到临床还需要更深入的研究。

A：巨噬细胞(SP法×200);B：CD4+ T细胞(SP法×400);C：CD8+ T细胞(SP法×400); D：CD3+ T细胞(SP法×400);E：自然杀伤细胞(SP法×200);F：B细胞(SP法×200).

图1 免疫细胞在结直肠癌中的浸润(略)

Fig 1 Immunocyte infiltrate in colorectal cancer

【参考文献】

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