流式细胞术CD45/SSC设门在急性白血病免疫分型中的应用

作者     　         作者单位

张春兴  南方医科大学南方医院肝胆外科， 广州

廖彩仙  南方医科大学南方医院肝胆外科， 广州

张守华  南方医科大学南方医院肝胆外科， 广州

苏俊    南方医科大学南方医院肝胆外科， 广州

周杰　  南方医科大学南方医院肝胆外科， 广州

1 材料与方法

1.1.1 实验动物

6～8周龄的SPF级纯系BALB/C雄性小鼠10只，重18～20?g，购于中山医科大学实验动物中心(SPF级，粤监证号2006A003)。

1.1.2 主要试剂和仪器

Lineage cell Depletion Kit、mouse Thy1.2 microbeads、Mini MACS分离器、LS和MS分离柱(德国Miltenyi Biotec公司),流式细胞仪(美国BD公司), FITC antimouse CD90(美国eBiosc公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠骨髓细胞收集

将小鼠颈椎脱臼处死，75%的酒精浸泡15?min。无菌游离双侧股骨胫骨，用4?℃含2%FCS的DMEM培养液吹出小鼠股骨和胫骨骨髓，收集骨髓细胞悬液。8?℃条件下1?500?r/min离心10?min，弃上清，加入红细胞裂解液6?mL，混匀，4?℃静置8?min。加入等体积的4?℃缓冲液Buffer(pH7.2 PBS，0.5%BSA，2?mmol/L EDTA)，8?℃条件下1?500?r/min离心10?min。弃上清，加入20?mL Buffer，混匀，30?μm 400目尼龙膜过滤，获取细胞悬液。细胞计数。取2.0×106个细胞分成10等份，采用FACS检测纯化前Thy1.2 lin-细胞百分比。

1.2.2 小鼠lin-细胞获取

将上述收集到的骨髓细胞悬液8?℃条件下1?500?r/min离心10?min，弃上清;按40?μL/107加入Buffer重悬细胞，按10?μL/107加生物素抗体，单克隆抗原簇CD3ε，CD4，CD8a，CD45R，Gr21，Ter119(≤1?μg/106细胞)，CD11b(≤0.25?μg/106细胞)混匀，4?℃冰箱孵育10?min。按30?μL/107加入Buffer，再按20?μL/107加入抗生物素抗体磁珠，混匀，4?℃冰箱孵育15?min。加入细胞悬液体积15倍的Buffer洗涤细胞，8?℃条件下1?500?r/min 离心10?min，弃上清。按500?μL/108加Buffer重悬细胞。用3?mL Buffer润LS柱，待洗柱液流尽后在柱中加入细胞悬液，收集lin-细胞液;再用3?mL Buffer洗柱子3次;筛选出Lin-细胞，计数。

1.2.3 小鼠Thy1.2+lin-细胞获取

lin-细胞悬液8?℃条件下1?500?r/min离心10?min，弃上清，按90?μL/107加入Buffer重悬细胞。按10?μL/07加CD90抗体磁珠，混匀，4?℃冰箱孵育15?min，按1?mL/107加入Buffer洗细胞1次，8?℃条件下1?500?r/min离心10?min，弃上清，按500?μL/108加入Buffer重悬细胞。Buffer 500?μL润MS柱，悬液过柱后，Buffer500?μL/次洗柱3次。柱子脱离磁场，加1?mL Buffer，用配套柱塞推出柱中的Thy1.2+lin-细胞，收集到Thy1.2+lin-细胞。细胞计数。取2.0×106个细胞分成10等份，FACS检测纯化后Thy1.2+lin-细胞百分比。

1.2.4 细胞活性检测

纯化前后分别取10?μL细胞悬液与台盼蓝溶液混合后，玻片显微镜下观察不着色、发亮的为活细胞，着色胀大为死细胞，计算活细胞的百分率。

1.2.5 细胞纯度和细胞回收率的计算

细胞纯度=分离产物中的阳性细胞数/分离细胞的总细胞数×100%

细胞回收率=分离产物中的阳性细胞数/起始标本阳性细胞总数×100%

1.3 统计学处理

SPSS11.5统计软件处理数据，检验方法采用两样本均数的t检验，分析纯化前后Thy1.2+lin-细胞的纯度及细胞活力的差别，数据用±s表示。

2 结 果

2.1 细胞数量和回收率

10只小鼠的股骨和胫骨共收集约2.32×108个骨髓细胞，平均每只小鼠两条股骨和胫骨可收集约2.32×107个骨髓细胞，利用MACS分离纯化后，Thy1.2+lin-细胞总数约为5.89×106，每只小鼠约为5.89×105，回收率为70.1%。

2.2 分选前后细胞光镜下的改变

筛选前的骨髓细胞光镜下表现为各种形态的多系成熟细胞和原始细胞的混合体，数量多，密度高，经过MACS分选后，光镜下细胞呈现为圆形淋巴细胞样的单个核母细胞，数量少，密度低。

2.3 分选前后细胞存活率及细胞纯度的变化

台盼蓝染色检测分选前后细胞存活率及FACS分析分选前后细胞纯度的变化见表1。

3 讨 论

肝硬化、肝代谢性疾病及肝炎等是临床常见病,约10%的患者最终死于肝功能衰竭,我国每年新增患者约400万人。目前治疗肝功能衰竭最有效的方法是采用肝组织或肝细胞移植,使肝衰患者的肝细胞再生到足以支持肝脏的生理功能。但由于供肝来源困难和自体肝细胞获取困难、增殖性差,制约了肝衰患者的治疗。自体骨髓来源肝干细胞移植是一种较为理想的治疗方法,不仅可以使因病变而减少的肝细胞数和因病变而破坏的肝组织结构得到恢复，将实现真正意义的病肝肝细胞的再生,纠正肝细胞代谢和合成功能障碍,而且自体骨髓中诱导肝干细胞具有无来源限制、不存在免疫排斥、不易受病毒或肿瘤的污染等优点。在人工肝方面,不仅可以在人工肝装置中利用骨髓源性肝干细胞衍生的肝细胞来净化血液,而且有可能利用肝干细胞制造出新的肝脏供移植使用。在先天性或代谢缺陷性肝脏疾病的治疗方面,自体骨髓细胞中的肝干细胞是较理想的转基因治疗的靶细胞,自体骨髓来源肝干细胞移植是有望代替肝(器官)移植的治疗方法。

骨髓细胞中存在肝干细胞群已为大家公认。Petersen等[10]将雄性大鼠的骨髓移植到雌性大鼠体内，术后发现雌性大鼠肝内有Y染色体阳性的卵圆细胞等，证实骨髓细胞能生成卵圆细胞和其他肝干细胞。但骨髓组织中的肝干细胞含量极低，本实验的目的是收获高纯度且保持原有活性的单一细胞群(CD90),并最大限度的减少靶细胞的丢失。评价一个分选方法或分选系统的主要指标包括整个分选过程所耗费的时间、靶细胞的回收率、纯度,以及分选后细胞的功能活性。以前细胞分选法常用密度梯度离心法和离心淘洗技术，该法简单易行，无需特殊条件设备，但分离纯度低，且细胞表面标志不明确，特异性差,目前已较少应用[1112];近来细胞分选主要通过流式细胞仪、亲和吸附、免疫磁珠法等进行。但前二种方法存在技术要求高、仪器设备昂贵、影响细胞活力、易于污染等不足[1314]。Wynter等[15]实验表明，免疫磁珠法系统具有分选效率高、操作简便、耗时短，不影响细胞功能、纯度及回收率高等特点,已广泛应用于基础和临床研究。但多应用于造血干细胞的分选,应用最多的是CD34+细胞分选[1617],对BMDLSC的分选报道较少。

本实验为得到高纯度BMDLSC亚群Thy1.2+lin-细胞，选用免疫磁珠法进行分选，策略是先阴性分选，后阳性分选，这样能尽量避免细胞不同表面抗原在结合磁珠后在同一磁场下的相互干扰，从而有效减少假阳性细胞，保证了目的细胞的纯度，还省略了不必要的消化剪切磁珠和洗涤细胞过程，减少细胞丢失，降低细胞活性功能发生改变的可能。在分离前用30?μm尼龙网过滤，有效的减少了组织碎片和细胞凝集块造成的非特异性，并且保证分离时不会因为凝集块阻塞LS和MS柱子而造成实验无法进行的严重后果。分选所采用的磁珠为超顺磁性的免疫微型磁珠，即其置于磁场时显示磁性，从磁场移出时无任何磁性物质残留于细胞悬液中。磁珠的直径为50?nm， 体积约为真核细胞的一百万分之一，可与病毒的大小相比，标记细胞上的微型磁珠即使在扫描电镜照片上也几乎看不到。由于微型磁珠体积很小，所以不会对细胞造成机械性压力，而且磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成，孵育时间短，操作过程快，细胞被污染的机率小。

Microbeads形成一个稳定的胶体液，它们在磁场中既不沉淀也不凝聚。微型磁珠的组成成分(氧化铁和多糖)不会对细胞产生化学刺激，同时容易生物降解，结合和分选过程中，细胞生理功能不会受影响及产生变化，细胞活力不会下降，分选后磁珠不需要去除，可立即用于分析和随后的各种实验研究。用免疫磁性细胞分选系统磁性分选细胞还要有好的一抗标记物和一、二抗结合率。对阳性细胞的标记要尽可能地强，而对背景的标记则要尽可能地弱，才能使阳性的磁性标记的成分和阴性的非标记的成分得到最好的分离效果。本试验选用了高特异性的单克隆抗体，从而优化了分选，在很短的时间内从复杂的细胞混合物中分离出纯度很高的目的细胞，而且有极高的回收率和存活率。

【参考文献】

[1]Petersen B E, Bowen W C, Patrene K D, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J]. Science, 1999, 284(5417):11681170.

[2]Crosby H A, Kelly D A, Strain A J. Human hepatic stemlike cells isolated using ckit or CD34 can differentiate into biliary epithelium[J]. Gastroenterology, 2001, 120(2):534544.

[3]Krause D S, Theise N D, Collector M I, et al. Multiorgan, multilineage engraftment by a single bone marrowderived stem cell[J]. Cell, 2001, 105(3):369377.

[4]Fausto N. Liver regeneration and repair: hepatocytes,progenitor cells and stem cells[J]. Hepatol, 2004, 39(6):14771487.

[5]Ledbetter J A, Rouse R V, Micklem H S, et al. T cell subsets defined by expression of Lyt1,2,3 and Thy1 antigens [J]. Exp Med, 1980, 152(2):280295.

[6]Basch R S, Berman J W. Thy1 determinants are present on many murine hematopoietic cells other than T cells[J]. Eur J Immunol， 1982， 12(5):359364.

[7]Bergstresser P R, Sullivan S, Streilein J W, et al. Origin and function of Thy1+ dendritic epidermal cells in mice[J]. Invest Dermatol， 1985， 85(1):8590.

[8]Radrizzani M, Carminatti H, Pivetta O H, et al. Developmental regulation of Thy 1.2 rate of synthesis in the mouse cerebellum[J]. Neurosci Res, 1995, 42(2):220227.

[9]Krause D S, Theise N D, Collector M I， et al. Multiorgan, multilineage engraftment by a single bone marrowderived stem cell[J]. Cell， 2001, 105(3):369377.

[10]Petersen B E, Bowen W C, Patrene K D, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J]. Science, 1999, 284(5417):11681170.

[11]Suzuki A, Zheng Y, Kondo R, et al. Flowcytometric seperation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver[J]. Hepatol, 2000, 32(6):12301239.

[12]Gehling U M, Willems M, Dandri M， et al. Pavrital hepatectomy induces mobilization of a unique population of haematopoietic progenitor cells in human healthy liver donors[J]. J hepatol, 2005, 43(5)：845853.

[13]Minguet S, Cortegano I, Gonzalo P, et al. A population of cKit(low)(CD45/TER119) hepatic cell progenitors of 11day postcoitus mouse embryo liver reconstitutes celldepleted liver organoids[J]. J Clin Invest, 2003, 112(8):11521163.

[14]Fujikawa T, Hirose T, Fujii H, et al. Purification of adult hepatic progenitor cells using green fluorescent protein (GFP)transgenic mice and fluorescentactivated cell sorting[J]. Hepatol, 2003, 39(2):162170.

[15]de Wynter E A, Coutinho L H, Pei X, et al.Comparison of purity and enrichment of CD34+ cell of bone marrow ,umbilical cord and peripheral blood (primed of apheresis) using five separation systems[J]. Stem cells, 1995, 13(5):524532.

[16]Lazzari L, Lucchi S, Montemurro T， et al. Evaluation of the effect of cryopreservation on exvivo expasion of hematopoietic progenitors from cord blood[J]. Bone Marrow Transplant, 2001, 28(7)：693698.

[17]Sauvageau G, Iscve N N, humphries P K. In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells[J]. Oncogene, 2004, 23(43)：72237232.