哮喘大鼠孤束核内H3受体对呼吸道P物质样免疫反应物的影响

作者                          作者单位

董榕    东南大学基础医学院 生理学与药理学系，江苏 南京 210009

胡春梅  南京市胸科医院，江苏 南京 210029

王月涵  东南大学基础医学院 生理学与药理学系，江苏 南京 210009

气道神经源性炎症在哮喘发病中的强大致病作用正日渐引起研究者的重视。非肾上腺素能非胆碱能神经(nonadrenergic noncholinergic,NANC)分布于气道管壁各层，其末梢释放速激肽类炎症介质，能引起支气管痉挛、血浆渗漏、黏膜水肿等呼吸道病理变化，与哮喘发病关系密切[1]。P物质(substance P，SP)是NANC神经纤维末梢释放的主要神经源性炎症介质。哮喘发作时，外周血、痰液和肺组织中的SP都明显增多[2]，同时肺内SP能免疫反应纤维数目和分布状态均发生非常明显的变化[3]。因此肺内感觉神经末梢SP释放增多可能是哮喘发病中的重要环节。如何降低SP等神经源性炎症介质对气道的损伤，是抑制或消除哮喘慢性气道炎症的一个突破口。组胺H3受体是一种新型突触前调制受体，能调控多种神经递质的释放。研究初步表明，存在于外周神经末梢的组胺H3受体通过调控递质释放在一定程度上能缓解哮喘。而广泛分布在中枢神经系统内的H3受体与哮喘气道炎症发生的关系尚未见文献报道。本研究以核团给药方式结合免疫组化方法，初步探讨孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS) H3受体与哮喘神经源性炎症的关系，为揭示哮喘发病机制以及开发有效的抗哮喘药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 哮喘模型制备

雄性成年SD大鼠24只，体重250～300 g，由东南大学实验动物中心提供，在安静、温暖(18～25 ℃)、避强光、明暗周期为10 h/14 h实验室预饲养1周后，随机分成哮喘模型组(n=18)和生理盐水对照组(NS组，n=6)。于实验第1天，每只模型组大鼠腹腔注射用卵蛋白(OVA)粉末100 mg、氢氧化铝干粉100 mg、灭活百日咳杆菌5×109个配成的混悬液1 ml 1次，自第15天开始用超声雾化器雾化吸入1%OVA生理盐水溶液(2～3 ml·min-1，颗粒直径≤5 μm)，每天1次，每次均以哮喘症状出现(烦躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困难、喘息、腹肌明显收缩、咳嗽等)作为指标，连续3 d。NS组大鼠在致敏和吸入激发阶段均以生理盐水代替OVA混悬液，吸入时间为同批哮喘模型组鼠最长诱喘时间。

1.2 核团定位和给药方法

模型大鼠乌拉坦(1 g·kg-1，ip)麻醉后，将鼠头固定于立体定位仪上，参照PaxinonsWatson大鼠脑立体定位图谱，以前囟为零点，定位左侧NTS(AP:-12.80 mm;L:1.2 mm;H:8.0 mm)。在给药部位借助立体定位仪预先埋一外径为0.78 mm的不锈钢管作为注射引导管，用502胶固定。用外径0.38 mm的不锈钢管作为注射管，注射管长于引导管0.5 mm，用一细聚氯乙烯管将注射管和微量注射器相连，将注射管插入引导管中准备给药。给药体积均为1 μl，用微量注射机恒速(1 μl·min-1)注射，注射后留管2 min。其中组胺H3受体激动剂Ramethylhistamine (RMHA，Sigma公司)临用前用无菌生理盐水配制成1、2 μg·μl-1;组胺H3受体拮抗剂thioperamide(Thio,Sigma公司)用无菌生理盐水新鲜配制成10 μg·μl-1，pH 7.2～7.4，低温保存，注射前置于37 ℃水浴箱中加温。

实验结束后用相同给药法在原点注射等体积美蓝后，将大鼠头浸泡在10%的甲醛液内，7 d后冰冻切大鼠脑片(40 μm)，查找注射点，对照大鼠脑图谱确定注射部位，凡未打中NTS的实验动物均剔除。

1.3 实验分组

将已成功制备的哮喘模型大鼠按NTS处注射不同药物再随机分为哮喘组(OVA+NS组)、OVA+RMHA组、OVA+Thio组3组，每组6只，3组在静脉注射OVA溶液(40 mg·kg-1，共0.1 ml)诱发哮喘急性发作后，依次往NTS内微量注射1 μl无菌生理盐水、1 μg RMHA、5 μg Thio，给药体积均为1 μl。

另外NS组于静脉注射0.1 ml无菌生理盐水后，NTS内微量注射1 μl无菌生理盐水。

1.4 组织标本制作

各组大鼠于静脉注射OVA激发哮喘急性发作、NTS内微量注射相应药物的10 min后打开胸腔，暴露心脏，剪开右心室，将灌注针插入肺动脉，剪开左心耳。先用100～200 ml生理盐水快速冲洗血液，直至流出的液体呈无色，然后再用4 ℃ 4%的多聚甲醛溶液400 ml持续灌注，先快后慢，约2 h。灌注完毕后取出支气管和右肺下叶，置4 ℃ 4%的多聚甲醛溶液中固定4 h，然后放入30%的蔗糖溶液中4 ℃过夜。

1.5 免疫组化方法(SABC法)

取出组织标本，用冰冻切片机切片，片厚40 μm，收集在切片盒中。切片经新鲜配制的0.3%甲醇H2O2溶液处理后，加入兔抗SP血清(1∶400，Sigma公司)，4 ℃过夜。加入即用型生物素化的羊抗兔血清(Sigma公司)，室温反应4 h，再加入链霉亲合素生物素过氧化物酶(SABC)复合物(Sigma公司)，室温2 h。每一步骤前均经0.01 mol·L-1的PBS(pH 7.4)充分漂洗3次，每次10 min。最后以葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍铵法显色。常规裱片，系列酒精(75%、95%、无水乙醇)脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。免疫组化染色替代试验：用PBS代替兔抗SP第一抗体，其他实验步骤不变。

1.6 计算机图像分析

使用加拿大Optimas 6.2图像分析系统，将待测切片置于连接计算机的显微镜下，彩色显示屏即出现待测切片的图像，用光笔勾画出支气管、细支气管管壁作为参照面积并测出其面积大小。图像处理系统对输入的图像作0～255级交互分割后，黑色为最小值0，白色为最大值255，选定SP样免疫反应阳性物进行灰度扫描，测定其阳性总面积，阳性总面积和参照面积的比值即为阳性密度值。每例动物随机抽取3～4张切片，每张切片随机选取4个视野，每组6只动物间取平均值，即为该组动物SPRIL的阳性密度值。用t检验比较各组间SP样免疫反应物的平均密度值，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 显微镜观察结果

所有免疫反应阴性对照片显色呈阴性反应。各组免疫反应切片上，SP样免疫反应物(SPRIL)被染成棕褐色，主要分布于支气管和细支气管的平滑肌层和上皮层。背景染色为淡黄色，对比鲜明。其中NS组大鼠肺内支气管壁可见稀疏、呈点状分布的SPRIL(图1 A)。OVA+NS组与NS组相比较，在同样抗体稀释浓度的条件下，SPRIL在哮喘大鼠肺内支气管管壁的数量明显增多，阳性物染色明显加深，颗粒变大，分布密集，平滑肌层增多更加明显;此外在肺泡壁中也可见较多SPRIL分布(图1 B)。OVA+RMHA组SPRIL在大鼠肺内终末细支气管壁均有少量分布，在呼吸性细支气管和肺泡壁中几乎没有SPRIL分布，跟NS对照组接近;与OVA+NS组相比，反应物数量明显减少，染色变浅(图1 C)。OVA+Thio组与OVA+RMHA组比较，大鼠肺内支气管管壁的SPRIL阳性物分布密集，染色深，有的聚集成束，此外在呼吸性细支气管和肺泡隔中可见较多SPRIL分布，阳性物分布范围和数量跟OVA+NS组比较接近(图1 D)。图1 大鼠细支气管壁内SPRIL ×100

2.2 SPRIL显微图像分析

与NS组比较，OVA+NS组在细支气管内SPRIL的平均阳性密度明显增高，差异有显著性(P<0.01)。OVA+RMHA组在细支气管内SPRIL的平均阳性密度值显著降低，已基本接近NS组，跟OVA+NS组相比差异有显著性意义(P<0.01)。OVA+Thio组细支气管内SPRIL的阳性密度明显增高，和哮喘组的结果相似，跟OVA+RMHA组相比差异有显著性意义(P<0.01)，见表1。表1 NTS内微量注射RMHA对哮喘大鼠急性 发作时下呼吸道SPRIL阳性密度的影响

3 讨 论

哮喘的基本病理特征是气道炎症，由NANC释放SP等导致的支气管收缩、血管扩张，血管通透性增加、炎性渗出、黏膜水肿等呼吸道炎症表现，称为神经源性炎症[1]。研究发现，哮喘模型动物及患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液中SP含量均明显升高，特别是在急性发作时，SP浓度进一步升高[2]。同时哮喘发作时肺内SP和CGRP能免疫反应纤维数目和分布状态均发生非常明显的变化[3]。结合SP可以引起哮喘样炎症反应的特性，提示肺内感觉神经末梢SP释放量的增多可能是哮喘发病的重要环节。但目前对于SP释放过程的研究仅仅局限于肺内局部神经纤维的轴突反射机制，没有涉及神经元的作用，也忽略了中枢神经系统通过反射机制对NANC的调控作用，因而未能阐明神经系统在哮喘发生中的重要作用。

组胺是中枢神经系统内一种非常重要的神经递质和(或)调质，通过和特异性受体结合，从而改变细胞的兴奋性而发挥其广泛的生理作用。其中，组胺H3受体是一种新型的突触前调制受体，在中枢分布极广，几乎存在于包括NTS在内的所有脑区，它不仅以自身受体的方式负反馈调节组胺的释放和合成，同时也以异身受体的方式存在于其它神经元末梢负反馈调节脑内Ach、5HT和NE的释放[4]，产生广泛的生理效应，从而有人将其称为“脑功能”的调节者[5]。为了初步探索中枢组胺H3受体作为脑功能的“调节者”，是否具有对哮喘神经源性炎症的调控作用，我们采用大鼠哮喘急性发作时NTS给RMHA后，免疫组化SABC法检测肺内SPRIL的变化情况，以此观察NTS内组胺H3受体激活与哮喘神经源性炎症的关系。

实验结果表明，哮喘发作NTS未给药时，肺内支气管至终末细支气管内以及呼吸性细支气管和肺泡壁均可见大量深染的SPRIL，主要集中在黏膜层和平滑肌层，同一个体不同大小支气管之间不存在SPRIR阳性分布密度的差异，与NS组相比，数量明显增多，差异有显著性。当哮喘发作NTS给予H3受体激动剂RMHA后，肺内的SPRIL与哮喘组相比，数量显著减少、阳性密度值降低，统计学检验差异有显著性，且在呼吸性细支气管和肺泡壁内不再见到SPRIL。我们试验同时观察到反映呼吸活动的指标呼吸频率、膈肌放电频率、膈肌放电幅度均基本恢复到哮喘发作前水平，而且在时间上与外周SP的减少相一致，与NS组较接近，这种效应可因预先注射Thio而阻断[67]。可见，NTS给予RMHA后下呼吸道内SPRIL数量的减少与呼吸功能的改善是相伴发生的，而且与中枢H3受体有关。提示中枢组胺H3受体很可能参与对外周气道感觉神经末梢内SP释放的调控，激活中枢组胺H3受体可减轻哮喘气道局部神经源性炎症反应，成为缓解气道阻塞症状的机制之一。这方面的研究对于探索哮喘发病的中枢机制、寻找新的抗哮喘途径具有非常重要的意义。

【参考文献】

[1]董榕，张敏. 侧脑室注射Rα甲基组胺对哮喘豚鼠呼吸道P物质样免疫反应物的影响[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2003,12(2):166170.

[2]HEANEY L G,CROSS L J,BUCHANNAN K D,et al. Neurokinin A is the predominant tachykinin in human brochoalveolar lauid in normal and asthmatic subjects[J].Thorax,1998，53(5):357362.

[3]CHU D L,SONG J F,RAO Z R. Changes of CGRP immunoreactive nerve fibers in the lungs of asthmatic mice[J].J Fourth Mil Med Uniu,2001，22(13):11681171.

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[5]BROWN R E,STEVENES D R,HAAS H L.The physiology of brain histamine[J].Prog Neurobiol,2001，63(6):637672.

[6]董榕，张敏，刘保森.中枢组胺H3受体对哮喘豚鼠呼吸运动的影响[J]. 中国应用生理学杂志，2006，22(1):117121.

[7]胡春梅，董榕.大鼠孤束核内H3受体对哮喘发作时脑组织中Fos蛋白表达的影响[J].东南大学学报：医学版,2005,24(6):371374.