膀胱癌免疫治疗的最新进展

作者                     作者单位

杨明根   中南大学湘雅二医院泌尿外科，湖南长沙 410011

王新君   中南大学湘雅二医院泌尿外科，湖南长沙 410011

赵晓昆   中南大学湘雅二医院泌尿外科，湖南长沙 410011

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在美国占肿瘤发病率的第四位[1]。以往除了用手术治疗外，还辅以药物膀胱内灌注治疗、热疗、光动力学治疗等，但都有一定的复发率和副作用，如最常见的化学性膀胱炎、癌细胞种植性转移等。1976年Morales[2]等率先报道了卡介苗(Bacille CalmetteGurin, BCG)治疗膀胱癌患者，从此，对于膀胱癌的免疫学治疗进展迅速。本文就近年来膀胱癌的免疫学治疗最新进展作一综述。

1 非特异性免疫治疗

1.1 BCG BCG是当前非特异性免疫治疗的代表药物，是一种减毒牛型结核分支杆菌疫苗,最早用于预防结核感染及加强对结核杆菌的特异性免疫。自从1976年Morales等[2]首先报道用BCG治疗膀胱癌以来，经过20多年的随机对照研究及大量临床实践证实，BCG膀胱腔内灌注在预防肿瘤术后复发、治疗原位癌、防止肿瘤进展、提高生存率及延长生存时间等方面是一种有效的生物免疫疗法[34]，其降低疾病发展速度、减少全膀胱切除术的机会和提高生存质量的效果明显优于其他膀胱灌注药物。

BCG作为一种减毒的活疫苗,有很强的抗原性、致敏性及残余毒性。随BCG治疗的病例数增加,其并发症也不断增加，主要为膀胱炎(67%)、血尿(23%)、发热(25%)和尿频(11%)[5]。BCG治疗后所产生的全身并发症是很少见的，然而Shoefeld[6]报道了比较严重的并发症，4 例产生长期的关节炎，其中一个发展为Reiter综合征，这可能与BCG 引起的自身免疫反应有关。这些严重并发症的发生限制了BCG的更广泛应用，并提示人们对这一疗法进行改进，于是人们开始致力于尝试减量治疗、寻找毒性小的菌株和从BCG里分离其有效成分来替代BCG。

Iric等[7]减少每次BCG的用量至40mg，结果发现膀胱癌复发率与正常剂量组无显著性差异，并可明显减少不良反应的发生，但因病例数较少，长期效果仍值得进一步研究。De Boer等[8]使用灭活的BCG灌注小鼠肿瘤模型发现产生的免疫效果与用活BCG灌注相似，但其抗肿瘤作用还需进一步研究。Morales等[9]从灭活的分枝杆菌提取了分枝杆菌壁提取物(mycobacterial cell wall extract, MCWE)对61例有浅表性膀胱癌的患者进行膀胱灌注治疗，经治疗后随访，大多数患者病情保持稳定，表现出极好的耐受性和极小的毒性，MCWE的剂量及毒性均较活性BCG小。近年来rBCG的构建和应用，使BCG在膀胱癌的治疗又迈向了一个新的阶段。用于治疗膀胱癌的rBCG有两种，一种是表达外来抗原的rBCG，由于BCG的持久刺激机体免疫系统特性，因此可用rBCG做为运载工具表达外来抗原，从而提高Th1型细胞免疫反应。Dhar等[10]报道用rBCG表达结核杆菌的抗原Ag85B，可以提高Th1型细胞免疫反应，并且可以通过rBCG来提高表达抗原，降低活BCG的剂量，提高其免疫效果，降低副作用。另一种是分泌细胞因rBCG表达分泌IFNC(rBCGIFNC)可以增加鼠MB49膀胱癌细胞株表达MHCI类分子，增加CD4+T 子的rBCG，由于一些细胞因子可以提高机体的细胞免疫，对肿瘤细胞可以进行杀伤作用，但临床用量大且副作用大，因此可利用BCG持久存在的特性，构建可分泌细胞因子的rBCG，用细胞的数量及局部产生IL2和IL4量的增加，并且rBCG可以引起Th1细胞免疫反应，升高血清INFC的水平，抑制肿瘤细胞的生长，延长其寿命[11]。

1.2 肿瘤疫苗治疗 肿瘤疫苗免疫治疗是利用肿瘤抗原进行主动免疫来激发、增强机体的主动特异性免疫反应。黑色素抗原(melanoma antigen, MAGE)作为肿瘤特异性抗原存在于许多肿瘤细胞中，其中包括膀胱肿瘤，而且发现随着膀胱癌浸润程度加深，MAGE的表达越明显。Nishiyama等[12]用自体同源的DC细胞荷载MAGE3肽，在体外实验中显示其诱导的特异性杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应显著强于MAGE3肽和单用DC;对4例晚期膀胱癌的治疗结果表明，DC细胞荷载MAGE3肽制成的疫苗，能够缩小转移淋巴结或肝转移灶的大小。

有学者试图转移基因到膀胱癌细胞从而建立肿瘤细胞疫苗来治疗膀胱癌，Kuromatsu等[13]用从分枝杆菌中提取的α抗原cDNA转染鼠膀胱肿瘤细胞株制备肿瘤细胞疫苗，运用这种疫苗可以导致原发肿瘤的排斥，接种这种疫苗的鼠在体内显示迟发型超敏反应，而且能诱发肿瘤特异性CTL，这一结果为α抗原在肿瘤细胞疫苗中的应用价值提供了有力的支持。Gomella等[14]为了评价痘苗病毒载体对人膀胱癌和黏膜的感染力及其副作用，在人膀胱移行细胞癌患者中进行了Ⅰ期临床实验。在行全膀胱切除之前，对4例有肌肉浸润的膀胱移行细胞癌患者，进行3次递增剂量的重组痘苗病毒膀胱灌注。结果显示：3例有显著的黏膜及黏膜下炎性细胞浸润，肿瘤和正常上皮均有病毒感染的证据，如体积较大的滤泡细胞等;没有临床和实验检查证据显示有与痘苗病毒感染明显相关的毒性反应，说明利用痘苗病毒载体转染细胞因子或其他基因到膀胱肿瘤细胞，从而建立原位肿瘤细胞疫苗的方案是可行的。

2 特异性免疫治疗

2.1 免疫毒素单克隆抗体复合物 免疫毒素BDI1RT(一种对抗人体膀胱癌的免疫毒素)，具有杀伤细胞作用的生物效应，它可连接到对肿瘤细胞表面抗原有特异性的单克隆抗体的分子链上，形成免疫毒素单克隆抗体复合物,并借助抗原抗体的特异性反应黏附到相应的肿瘤细胞上，起到杀伤肿瘤细胞的作用。Zang等[15]对免疫毒素作为预防膀胱癌切除后复发的辅助治疗作了一个评价，所用的制剂为在体外制备抗人膀胱癌的免疫毒素BDI1RT。以丝裂霉素C(MMC)治疗作为对照组，研究发现，BDI1RT 在膀胱癌中的活性为81.6%，BDI1RT的免疫活性与肿瘤分级有关，高分化癌比低分化癌染色性强(P<0.05);在复发率方面BDI1RT与MMC组无显著差异;副反应在MMC组更常见;通过对比后认为免疫毒素在预防膀胱癌治疗中更有潜在的价值。

2.2 放射免疫治疗(radioimmunotherapy, RIT) RIT是将具有治疗作用的核素与载体偶联进行的导向治疗，是目前研究最多的导向治疗方法之一。与膜结合的黏液腺分泌的高分子糖蛋白MUC1(Mucin1)，在膀胱癌病例中高度表达,可作为放射免疫治疗的有用靶位[16]。C595抗体，即抗MUC1黏液腺抗体(anti MUC1 mucin antibody)对MCU1有高度亲合性[17]，以C595为载体，联接放射性元素所形成的复合物灌入膀胱癌病例的膀胱后,C595复合物与膀胱癌细胞上的MCU1结合,利用放射性元素的放射作用杀伤肿瘤细胞。

Murray等[18]报告用铼188C595(Re188C595)抗体复合物指向该靶位并指引经膀胱放射免疫法治疗浅表性膀胱癌，Re188高铼酸盐从钨188/铼188(W188/Re188)反应堆中提取。C595抗体用2疏基乙醇纯化并用含二价锡的酒石酸盐作标记，用亲和分离方法从混合物中分离出特异性完整的抗体复合物，数值由色谱法测定。肿瘤的定位用人类的非活性膀胱标本作模块，复合物的示踪剂由γ闪烁扫描法来显示。结果：抗体复合物的免疫活性为70%±17%，对MUC1抗原有特异性。色谱法观察到抗体复合物蛋白的相应顶点峰值为150Kpa，表明复合物是单一的。结果显示：由Re188标记的C595抗体能准确定位到非活性模型和经膀胱灌注的患者的肿瘤细胞上，具有良好的放射连接性和高度的免疫活性和特异性,这种方法将有助于拓展治疗浅表性膀胱癌的治疗方法。

2.3 抗体介导的酶前体药物疗法(antibodydirected enzyme prodrug therapy, ADEPT) 多种酶可以与载体相偶联，特异性地聚集于肿瘤部位激活无生物活性的前体药物，使之转变为具有高度肿瘤杀伤活性的物质在局部发挥抗癌作用。可用于制备免疫偶联物(immunoconjugate, IC)的酶有：羧肽酶C2、羧肽酶A、青霉素酰胺酶、胞嘧啶脱氧酶等。近年来，有学者们尝试将ADEPT用于膀胱癌的治疗并取得了不错的效果。Syrigos等[19]用苦杏仁甙β葡萄苷酶系统进行了膀胱癌细胞的特异性杀伤实验。他们首先将β葡萄苷酶与单抗HMFG1偶联，将此偶联物与膀胱癌细胞在生理条件下孵育24h，然后清除非特异吸附的酶以后，引入苦杏仁甙，苦杏仁甙在β葡萄苷酶的作用下特异地在肿瘤表面转化为氰化物，毒性提高115倍，杀死靶细胞，并呈明显的量效关系，而非靶细胞不受抑制。随后所进行的临床前期实验显示:膀胱灌注HMFG1β葡萄苷酶并保留2h，冲洗膀胱后引入苦杏仁甙，可以达到特异杀伤瘤细胞所需的前体药物及酶的剂量及浓度。由于膀胱的解剖学特点，膀胱癌特别适合进行ADEPT，其应用价值前景还是比较广阔的。

3 过继性细胞免疫治疗

过继性细胞免疫治疗是将肿瘤患者体内具有抗肿瘤细胞性能的淋巴细胞在体外用白介素Ⅱ(interleukinⅡ, IL2)进行培养、扩增至一定数量时，回输至该患者的体内，用这些具有抗肿瘤细胞性能的淋巴细胞去杀伤或杀灭肿瘤细胞，以达到抗肿瘤的目的。

3.1 肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltration lymphocyte, TIL) Rosenberg等 [20]于1986年发现从实体肿瘤组织中分离的TIL，在体外经IL2激活、培养、扩增后，对肿瘤细胞具有高度的杀伤活性，其抗癌效果比LAK细胞要强50-100倍。由于TIL治疗时只需要少量IL2，副作用较轻，因此LAK/IL2疗法更具有潜在的临床应用价值，经过多年的临床应用，这一优越性得到了进一步的证实。

TIL来源于肿瘤组织内的淋巴细胞，在体外扩增后再回输入肿瘤患者的体内，这些淋巴细胞具有识别肿瘤细胞的信息，被称为细胞毒性T淋巴细胞或杀伤性T细胞，它带有特异性治疗作用，进入体内可以达到增强宿主抗肿瘤能力的目的。Li等[21]把增殖的TIL注入37例已施行膀胱癌膀胱部分切除术的患者膀胱内，发现CD3+、CD4+显著增加，而CD8+稳定，CD4+/CD8+增加到1.60。血、尿中IL2、α2TNF增加显著，特别是尿中α2TNF水平。膀胱镜下病理活检示:非特异性炎症是治疗后膀胱黏膜中的主要变化，37例患者随访6-26个月后，只有1例膀胱黏膜中异质变化，复发率为2.7%，治疗中除了低热和血尿外未见其他副反应。此方法既能提高膀胱局部抗肿瘤的能力，同时也提高全身的免疫反应，能有效地防止浅表性膀胱癌的复发。

3.2 树突状细胞(dendritic cell, DC) DC是目前所知的功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(Native T cell)的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)，具有强大的激活CD8+CTL及CD4+T辅助细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，在免疫应答中处于中心地位，因而成为肿瘤免疫反应的中心环节。自体树突状细胞加入肿瘤抗原后能有效的产生肿瘤特异性CTL。用自体DC加到MAGE3的抗原决定基团IMPKAGLLI(一种黑色素瘤抗原23缩氨酸多肽类物质，即Melanoma antigens3 epitope pepetides)上，来治疗浸润性膀胱癌作为一种新的免疫治疗方法，IMPKAGLLI的合成由HLAA24特异性决定，共有4个HLAA24(+)，表达MAGE3的浸润性膀胱癌的患者，注射自体DCs加IMPKAGILI，每2周最少6次，最多8次，其中3例转移淋巴结明显缩小，这些患者未见明显的副作用[12]。

4 细胞因子

4.1 干扰素(Interferon, IFN) IFN是一种很强的生物反应调节剂，有抗病毒、抗肿瘤、抗血管增生及免疫调节等多种作用。膀胱癌细胞表达高水平的IFNα受体，而且肿瘤分级越高，其受体的密度越大[22]。IFNα受体的密度或许将来能成为选择干扰素α治疗的重要因素。Rajala等[23]对术后行1次IFNα2b灌注效果进行研究,发现与使用化疗药组比较有明显差异，而与未灌注组无显著性差异。BCG灌注后IFNγ在尿液中浓度升高,推测其可能参与抗肿瘤过程。Champelovier等[24]用IFNγ作用于体外肿瘤细胞系发现剂量与疗效呈正相关，大剂量IFNγ对肿瘤细胞有抗瘤作用,而小剂量会产生耐药性，可能会是引起肿瘤进展的一个原因。Stavropoulos等[25]使用IFNγ灌注,每次0.7mg，每周1次共8次，将1年复发率由86%降至62%，长期效果需进一步研究。

来自临床的资料已经表明：单一的IFN对膀胱癌治疗的效果不理想，仅考虑做为联合应用或不耐受BCG或化疗药物的患者较理想的替换剂较为合适[26]。Punnen[27]报告BCG减量与IFN2合用的疗效，12例患者治疗1年后50%无肿瘤复发;在6例复发患者中，3例对膀胱内治疗无反应。Mohanty等[28]对膀胱肿瘤患者行BCG(60mg/次)加IFNα2b(500万U/次)膀胱灌注,5年内36%无肿瘤复发，进展率仅为20%，未出现明显毒性反应及不良反应。

4.2 白介素Ⅱ(interleukinⅡ, IL2) IL2可以诱导或促进多种细胞毒细胞的活性，如NK、CTL、LAK和TILK等细胞，这些细胞在机体抗肿瘤免疫方面至关重要。早在80年代，临床上即开始静脉注射IL2治疗晚期恶性肿瘤。重组型IL2的问世使得临床上能够开展较大剂量的研究，目前认为IL2与LAK细胞或其他抗癌制剂联合应用可发挥其明显的抗瘤作用，故很少采用单独IL2治疗的措施。Kaempfer等[29]在用BCG治疗浅表性膀胱癌的研究中发现，凡对治疗反应很好的患者，其IL2mRNA的表达明显提高。IL2的作用值得更多的实验研究观察。

5 结论与展望

由于膀胱独特的解剖结构及膀胱灌注局部应用的有利条件，使得膀胱癌在免疫治疗中尤其具有独特的优势。就目前文献报道来看，主动性免疫治疗以卡介苗为代表仍然是膀胱癌的最主要的免疫治疗方法，特别是对浅表性膀胱癌。近年来rBCG的构建和应用，使BCG在膀胱癌的治疗又迈向了一个新的阶段。尽管肿瘤疫苗的研究取得了一些进展，但目前肿瘤疫苗尤其是基因工程疫苗在临床上治疗膀胱癌还面临许多尚未攻克的难题。IC用于膀胱癌治疗的效果已得到了肯定，其中免疫毒素和ADEPT被认为已能将治疗剂量的肿瘤杀伤因子特异地浓聚于肿瘤发挥细胞毒作用而较有发展前途。目前由于对DC的研究还存在许多难题，但相关实验已证实其疗效是确切和显著的，具有良好的运用前景。膀胱内联合灌注重组干扰素α和BCG对于治疗膀胱癌患者是一种有用的选择。近年来随着分子生物学、分子免疫学及相关技术的突飞猛进的发展，膀胱癌的免疫学治疗方法日渐增多且不断创新，其治疗的有效性也日益突出。因此，肿瘤免疫学疗法的应用前景是相当广阔的，它必将成为我们日后战胜肿瘤的一种强有力的武器。

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