门静脉高压症脾亢患者外周血CD4^＋CD25^＋CD127^low/-调节性T细胞含量与免疫功能研究

作者                        作者单位

郭勇      温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000

陶崇林    温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000

吴存造    温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000

廖毅      温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000

张启瑜　　温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000

Research on the content and the immune function of CD4+CD25+CD127low/- regulatory T cells in peripheral blood of patients with portal hypertension and hypersplenism GUO Yong， TAO Conglin， WU Cunzao， et al. Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000

Abstract Objective To investigate the changes of expression of CD4+CD25+CD127low/- regulatory T cells and CD3+， CD4+， CD8+ T cell in peripheral blood of patients with portal hypertension (PHT) and hypersplenism， explore the changes in splenic immune function and its possible regulative mechanism. Methods The ratios of CD4+CD25+CD127low/- Treg and CD3+， CD4+， CD8+ T cell in peripheral venous blood were examined with flow cytometry in 20 patients with PHT and hypersplenism，and compared with 18 healthy individuals. Results The ratios of CD4+CD25+CD127low/-/CD4+ in PHT group were (5.3±3.0)%. It was significantly increased compared with healthy group (2.5±0.9)% (P<0.01). The ratios of CD3+， CD4+， CD8+ T cells were decreased in patients with PHT compared with healthy group(P<0.05). There was a negative correlation between CD4+CD25+CD127low/- and CD3+， CD4+ (r=-0.630， P<0.01; r=-0.561， P<0.05). Conclusion The expression of CD4+CD25+CD127low/- Treg are significantly increassed in patients with PHT and hypersplenism， it may play an important role in splenic immunomodulatory.

Key words hypertension, portal; hypersplenism; CD4+CD25+CD127low/- regulatory T cells; immune function

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)在体内外具有免疫调节功能，分为自然Treg细胞和适应性Treg细胞。自然Treg细胞有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性，是机体免疫功能调节的重要机制之一。研究发现，用CD4+CD25+CD127low/- Treg代表自然Treg，能区别有活化效应的辅助性T淋巴细胞[1]。门静脉高压症(PHT)合并脾功能亢进(脾亢)时，患者的免疫功能处于紊乱状态，但其调节机制尚不清楚。本研究通过流式细胞术检测PHT脾亢患者外周血中CD4+CD25+CD127low/- Treg及CD3+、CD4+、CD8+ T细胞的表达变化，探讨CD4+CD25+CD127low/- Treg在门静脉高压症脾亢时脾脏免疫功能调节中的作用及临床意义。

1 资料和方法

1.1 对象 2009年4～8月我院收治的20例肝硬化PHT患者，男12例，女8例，年龄39~88岁。腹部B超均显示肝硬化、脾肿大。血细胞一系或多系减少。14例行胃镜检查示食管胃底静脉曲张。健康对照组18例，为2009年6～8月在我院健康体检的成人，年龄31~68岁。

1.2 试剂和仪器 荧光标记的鼠抗人单抗CD4-PE、CD25-FITC、CD127-Alexa Fluor?誖647，CD3-PE、CD8-FITC、阴性对照mouse IgG1 FITC和IgG1 Alexa Fluor?誖647，红细胞裂解液Lysing Buffer，FACSCalibur流式细胞仪，均购自美国BD Bioscience公司。

1.3 检测方法 EDTA管收集外周静脉血后3 h内进行检测。每例标本取三个试管，分别加CD4-PE/mouse IgG1 FITC/IgG1 Alexa Fluor?誖647、CD4-PE/CD25 FITC/CD127 Alexa Fluor?誖647及CD3-PE/ CD8-FITC各10 μL，每管再加入100 μL 抗凝全血后混匀避光孵育25 min;加2 mL 1×Lysing Buffer，混匀避光孵育15 min;溶血后PBS洗2次，最后加200 μL含1%多聚甲醛PBS重悬并流式细胞仪上机检测。

1.4 统计学方法 组间比较采用t检验，相关分析采用线性相关分析法。

2 结果

2.1 外周血中CD4+CD25+CD127low/- Treg及CD3+、CD4+、CD8+ T细胞的表达变化 脾亢组患者CD4+CD25+CD127low/- Treg占CD4+ T细胞的比例明显高于对照组(P<0.01)。脾亢组CD3+、CD4+、CD8+ T细胞的含量均低于对照组(P<0.05)。见表1、图1。

2.2 脾亢组各检测指标之间相关分析结果 脾亢组CD4+CD25+CD127low/- Treg含量与CD3+ T细胞显著负相关(r=-0.630，P<0.01，见图2);与CD4+ T细胞呈负相关(r=-0.561，P<0.05，见图3)。

3 讨论

CD4+CD25+ Treg是研究较为深入的自然Treg，其具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性。其免疫无能性表现在对高浓度IL-2的单独刺激，固相包被或可溶性抗CD3单抗，以及抗CD3单抗、抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不分泌IL-2。免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+和CD8+ T细胞的活化和增殖[2-4]。CD127是白细胞介素(IL)-7受体α链，其表达对T淋巴细胞的成熟、维持及免疫应答发挥着重要作用。近几年来主要以CD4+CD25high和Foxp3(叉头翼状螺旋转录因子)作为人CD4+CD25+ Treg的特异性标记物。但Foxp3为细胞核染色，标记后细胞被破坏，不能用于进一步培养和研究，而且并不是所有Foxp3阳性的细胞都是调节性T细胞，因为Morgan等[5]发现人类Foxp3mRNA不仅在CD25+ T细胞上表达，在CD25- T细胞活化后也可短暂表达。Liu等[1]发现CD127与Foxp3表达呈负相关，Seddiki等[6]发现CD4+ T细胞活化后高表达CD127，即CD4+CD25+CD127high，而真正有活化效应的调节性T细胞仅低表达CD127，即CD4+CD25+CD127low/-。研究表明CD4+CD25+CD127low/-是自然产生的Treg最好的细胞膜标志物[7]。

在PHT脾功能亢进的治疗中，手术是否保留脾脏的争议较多，其中最主要的争论在于对脾脏免疫功能的认识。脾脏是机体最活跃的免疫器官，每天约有身体总淋巴细胞数的1/4通过脾脏。目前对肿大的脾脏的免疫功能评价尚未达成统一认识，其调节机制尚不清楚。CD表示“分化群”，是指一个单克隆抗体细胞群识别的一个分子，是识别淋巴细胞的标记物[8]。CD细胞在机体特异性免疫应答及免疫调节中起重要作用。维持机体正常的免疫功能，有赖于各种免疫细胞特别是T细胞亚群之间相互协作或制约。目前对脾亢时脾脏免疫功能的研究多体现在T、B淋巴细胞及各种免疫因子的表达变化上。例如，吴仕和等[9]观察到，PHT患者外周血促吞噬肽水平、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明显低于正常对照组。但引起其免疫功能变化的机制尚不清楚[10]。本研究发现，PHT脾亢患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+ T细胞的含量均低于对照组(P<0.05)，提示脾亢患者免疫功能低下。CD4+CD25+CD127low/- Treg对免疫功能的抑制性主要体现在能够抑制T细胞的活化和增殖，实验结果显示，脾亢患者CD4+CD25+CD127low/- Treg含量明显高于对照组(P<0.01)，且CD4+CD25+CD127low/- Treg含量与CD3+、CD4+ T细胞呈负相关，这说明其功能在脾功能亢进时具有重要意义，可能是引起T淋巴细胞降低、导致脾脏免疫功能下降的因素之一，在门静脉高压症脾功能亢进时可能具有重要临床意义。

【参考文献】

[1]　 Liu WH， Putnam AL， Zhou XY， et al. CD127 expression inveresely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells[J]. J Exp Med，2006，203(7)：1701-1711.

[2] 　Shevach EM. CD4+CD25+ suppressor T cells： more questions than answers[J]. Nat Rev Immunol，2002，2(6)：389-400.

[3]　 Ramsdell F， Ziegler SF. Transcription factors in autoimmunity[J]. Curr Opin in Immunol，2003，15(6)：718-724.

[4]　 Sakaguchi S. The origin of FOXP3 expressing CD4+ regulatory T cells： thymus or periphery[J]. J Clin Invest，2003，112(9)：1310-1312.

[5] Morgan ME， van Bilsen JH， Bakker AM， et al. Expression of FOXP3 mRNA is not confiened to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans[J]. Hum Immunol，2005，66(1)：13-20.

[6] Seddiki N， Santner-Nanan B， Martinson J， et al. Expression of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cell[J]. J Exp Med，2006，20(3)：1693-1700.

[7]　 Hartigan-O′Connor DJ， Poon C， Sinclair E， et al. Human CD4+ regulatory T cells express lower levels of the IL-7 receptor alpha chain(CD127)， allowing consistent　identification and sorting of live cells[J]. J Immunol Meth，2007，319(1-2)：41-52.

[8]　 姜洪池，陈孝平. 实用肝脾外科学[M]. 北京：科学出版社，2003：552-554.

[9] 　吴仕和，仇登波，黄韬. 门脉高压症患者脾脏免疫学研究[J]. 湖南医学，2001，18(1)：1-4.

[10]　姜洪池，乔海泉，代文杰. 脾脏外科：近20年的进展与展望[J]. 中华肝胆外科杂志，2002，8(1)：3-6.