去甲雄三烯醇酮的化学修饰及其免疫原性的构建

作者                      作者单位

周成林   江苏大学检验医学研究所免疫研究室，江苏 镇江212013

苏兆亮   江苏大学检验医学研究所免疫研究室，江苏 镇江212013

朱卫华   镇江出入境检验检疫局，江苏 镇江212008

王胜军   江苏大学检验医学研究所免疫研究室，江苏 镇江212013

李平     江苏大学化学化工学院，江苏 镇江212013

许化溪   江苏大学检验医学研究所免疫研究室，江苏 镇江212013

Construction of trenbolone antigenicity following it′s chemical　structure modification

ZHOU Chenglin, SU Zhaoliang1, ZHU Weihua3, WANG Shengjun1, LI Ping2，XU Huaxi1

(Department of Immunology, Institute of Clinical Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013; Zhenjiang EntryExit Inspection and Quarantine Bureau, Zhenjiang Jiangsu 212008;School of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013，China)

[Abstract]Objective: To prepare trenbolone(TR) complete antigen and identify the antigenicity of TR. Methods： TRhalfsuccinate(TRHS) was produced by TR reacting with succinic anhydride, the mixed anhydride and the [3mercaptopropionic acid, 1ethyl3(3diethylaminopropyl) carbodiimide，EDC] methods were used to couple TRHS and BSA. The antigenicity analysis of TRBSA complex was finished by detecting the titre of antiserum separated from rabbits which was immunized with TRBSA. Results: The TRHS molecular weight was determined as 370 by analysis of mass spectrometry, the absorption peak was in accordance with theoretical results by nuclear magnetic resonance. MALDITOFMS analysis showed that the molecular weight map of TRBSA a marked increase and the UV maximum absorption peak drift; the coupling ratios of mixed anhydride and EDC method were 1∶18 and 1∶12, respectively. The results of ELISA and double immunodiffusion test showed that the titre of antiserum to TR was 1∶320 000,1∶16, respectively. Conclusion: RBSA coupling was successfully prepared, which established the foundation for the antiTR monoclonal antibody preparation as well as the method construction of TR Residues rapid test.

[Key words]trenbolone; hapten modification; coupling; MALDITOFMS

去甲雄三烯醇酮,又称群勃龙(trenbolone，TR)，是人工合成的甾类男性激素，是家畜的生长促进剂，服用含该激素的肉制品会给人类的身体健康带来危害，同时也成为体育比赛兴奋剂的一个可能来源。欧盟禁止进口使用该类产品的食品，也是我国海关规定必须检测的31种兽药之一[1]。目前，TR在食品中残留量的检测主要依赖于质谱技术，如气相色谱质谱技术(GCMS)、液相色谱质谱技术(LCMS)等[2]。近年来，随着单克隆抗体技术、现代免疫测定技术的发展，建立方便于基层检验检疫部门应用的快速、灵敏的TR检测方法，对从源头上监测、控制此类物质的扩散具有重要意义[3]。TR是小分子化合物，需要与大分子载体(蛋白质)偶联后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐对TR进行化学修饰，并将获得的TR半琥珀酸酯(TRHS)与牛血清白蛋白(BSA)偶联以赋予其免疫原性，经注射家兔分析其免疫效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

紫外扫描仪、核磁共振仪、质谱分析仪、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDITOFMS);BSA、TR等购自Sigma公司;琥珀酸酐、三正丁胺、吡啶、异丙醇均由中国医药集团提供。

1.2 方法

1.2.1 TRHS的制备及鉴定

1.2.1.1 群勃龙结构的修饰

于烧瓶中加入500 mg TR和1 000 mg琥珀酸酐，然后加入2 ml吡啶溶解，80℃搅拌反应3 h。反应液冷却至室温，调整其pH为3.0，得棕黄色黏稠物，过夜后变硬。用热的异丙醇重结晶提纯，红外灯烘干即为TRHS(图1)。

1.2.1.2 修饰物的鉴定

采用质谱法对其相对分子质量进行预测，并用核磁共振鉴定。

1.2.2 TR的抗原性修饰

1.2.2.1 混合酸酐法[4]

TRHS与BSA按摩尔比100∶1反应。取TRHS 5.5 mg 溶于2 ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，置4℃冰箱中预冷10 min，于冰浴磁力搅拌，加入三丁胺30 μl，再加入氯甲酸异丁酯15 μl，然后将该溶液置4℃冰箱中反应1 h即为反应Ⅰ液;取20 mg BSA 溶于2 ml蒸馏水，溶解后于冰浴边搅拌边用1 mol/L NaOH 调pH为8.5制得Ⅱ液;边搅拌边将Ⅰ液缓慢滴加到Ⅱ液中，于4℃搅拌反应过夜。反应产物充分透析，即得TRBSA 偶联物溶液，将其冷冻干燥保存。

1.2.2.2 对乙基-N,N-二甲基丙基碳二亚胺

[3mercaptopropionic acid, 1ethyl3(3diethylaminopropyl) carbodiimide，EDC]法[5] TRHS与BSA按摩尔比100∶1反应。取TRHS，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，EDC按摩尔比1∶1∶1溶于1 ml DMF，混匀后于4℃下活化1 h,此为反应Ⅰ液;取10 mg BSA 溶于3 ml双蒸水中，加DMF 0.5～1.0 ml混匀, 4℃预冷20 min，得Ⅱ液;边搅拌边将Ⅰ液缓慢滴加到Ⅱ液中，于4℃搅拌反应过夜。反应产物充分透析，即得TRBSA 偶联物，冷冻干燥保存。

1.2.3 TRBSA免疫家兔

将制备的TRBSA用完全福氏佐剂常规法免疫家兔，获得的免疫血清用ELISA间接法和双向免疫扩散测定特异性抗血清效价，分析其免疫原性并判断免疫效果。

2 结果

2.1 群勃龙的化学修饰与修饰物鉴定

修饰产物质谱分析相对分子质量为370，IR(KBr)υmax：3300, 1738 cm-1;1H NMR(400 MHz, CDCl3, rt): δ=0.96(s, 3 H, CH3), 1.32(m, 1 H, CH2), 1.54(m, 3 H, CH2), 1.61(m, 1 H, CH2),1.93(d, 1 H,J=12.4 Hz, CH2), 2.27(m, 1 H, CH2), 2.44～2.60(m, 5 H, CH2), 2.69～2.72(m, 4 H, CH2), 2.86(m, 2 H, CH2), 4.84(t, 1 H, J=7.6 Hz, OCH), 5.81(s, 1 H, CH),6.36(d, 1 H, J=9.6 Hz, CH), 6.44(d, 1 H, J=10.0 Hz,CH),氢为25(图2)，由于羧基的氢活性太强故未出峰，13C NMR所示碳原子数为22个，各根值与理论值相符(图3)。

2.2 TRBSA的制备

2.2.1 偶联物的紫外光谱及偶联比[3]

紫外/可见分光光度仪对BSA进行扫描测定，可见BSA最大吸收峰在278 nm处,TRHS最大吸收峰在353 nm处,混合酸酐法偶联物的峰形发生明显变化，278 nm吸收峰明显降低，且在340 nm处吸收值明显增大，说明偶联是成功的(图4);由图5可见EDC法偶联物的峰形也发生明显变化，278 nm吸收峰明显降低，且在343 nm处吸收值明显升高，说明偶联也是成功的(图5)。

按文献[7]估算偶联比率，选择20%乙醇为溶剂并以之调零。混合酸酐法：TRHS浓度为0.035 mg/ml，BSA浓度为2 mg/ml，结合比约为1∶18;EDC法：TRHS浓度同混合酸酐法，BSA浓度为1.9 mg/ml，结合比约为1∶12。

2.2.2 BSA，TRBSA相对分子质量

用MALDITOFMS仪检测BSA和混合酸酐法制备的TRBSA，两者的相对分子质量分别为67 146和74 471(图6)。由此估算偶联比率为20.8。

2.3 TR特异性抗血清效价测定结果

TRBSA免疫的家兔血清，经ELISA测得TR特异性抗体效价为1∶320 000;双向免疫扩散测得的抗血清效价为1∶16。

3 讨论

群勃龙(TR)是在畜牧业养殖中经常使用的一类人工合成的类固醇激素，这类激素的滥用对人和畜的健康、社会和生态环境造成直接和潜在的威胁。因此，20世纪80年代以后许多国家明令禁止在牲畜的饲养中使用这类激素，但由于利益的驱动，世界范围仍有许多TR等类固醇激素在使用。国内外关于尿、血、组织中检测到TR等类固醇激素残留的报道很多[2, 6,7]。目前关于TR残留量的检测方法主要依赖于质谱技术。但质谱技术不适用于基层检验检疫部门快速的筛选检测。

本研究将TR与琥珀酸酐反应并对反应产物TRHS的性质和纯度进行鉴定。经磁共振及质谱分析，相对分子质量、氢谱、碳谱均符合TR结构式，并对修饰产物磁共振氢谱、碳谱与软件所预测的理论值进行了比较，结果显示完全一致，由此认为本研究所采用的TRHS合成方法是一种实用、有效的TR修饰方法。鉴定后的修饰产物采用混合酸酐法及EDC法与BSA偶联。在混合酸酐法实施过程中，严格控制反应Ⅰ液无水，Ⅰ、Ⅱ液混合时遵循Ⅰ液加入Ⅱ液，以使有机溶剂得以稀释。此外，在试验过程中，温度的严格控制可保证蛋白质性质。而在EDC法实施过程中，要严格控制EDC使用量[4，5]，因为EDC与羧基反应所形成的氨基反应活性中间体(O酰基脲)很不稳定，在水中会很快水解释放出羧基以及N酰基化脲。过量的EDC产生的N酰基脲会结合在蛋白疏水区域的羟基上，导致蛋白自交联。NHS的介入，可保持水溶液中中间体的稳定，使整个偶联反应分成独立的两步反应[7]，从而保证偶联效果。

理想的偶联比率与准确的偶联物相对分子质量的测定，是构成免疫原性的要素[8]。本研究使用MALDITOFMS预测偶联物相对分子质量，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，是生命科学领域一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用[9]。MALDITOFMS分析可直观测得偶联物相对分子质量，并通过计算获得其偶联比率。但该法所需设备昂贵，基层单位难以开展。

采用经上述方法作抗原性修饰后的TR免疫家兔并用ELISA和双向免疫扩散检测其抗血清效价，结果表明TR被赋予了明显的免疫原性，两种方法测得的抗TR特异性抗血清效价分别为1∶320 000和1∶16。TR免疫原性修饰的成功，为进一步制备TR单克隆抗体和建立特异性免疫学检测方法奠定了基础，为食品或其他物品中TR残留量的分析开辟了简便、特异、快速、敏感的途径，可从源头上监测、控制含有TR等类固醇物质食品的扩散。

【参考文献】

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