DCCIK细胞的生物学活性及抗淋巴瘤细胞的作用

作者                  作者单位

魏绪仓  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

连小云  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

赵文理  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

杨娣娣  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

韩秀蕊  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

邢佩霓  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

李梅生  陕西省人民医院血液病研究室，陕西西安 710068

The biological activity and antitumor effect against　lymphoma cells in DCCIK cells

Wei Xucang, Lian Xiaoyun, Zhao Wenli, Yang Didi, Han Xiurui, Xing Peini,Li Meisheng

(Department of Hematology, Shaanxi Provincial Peoples Hospital, Xian 710068, China)

ABSTRACT: Objective To investigate the proliferation activities, phenotype changes, level of secretory cytokines and antitumor activity against lymphoma cells of DCCIK cells in coculture of cytokineinduced killer (CIK) cells with dendritic cells (DC). Methods DC and CIK were prepared from healthy human peripheral blood mononuclear cells. They were cocultured peripherally. CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapanblue staining, killing activity was detected by MTT assay, cells phenotypes were analyzed by flow cytometry, secretions of INFγ and IL12 were determined by ELISA. Results The proliferation activity of DCCIK cells was significantly higher than that of CIK cells (P<0.05). Under the same condition, the ratio of CD3+ CD56+ and CD3+ CD8+ double positive cells in CIK cells was significantly enhanced by coculture with DC (P<0.05). In DCCIK cells, the level of IL12 and INFγ in culture supernatants was increased noticeably on day 3 compared to CIK cells which were cultured alone (P<0.01, P<0.05). At the effectortarget ratio from 5∶1 to 40∶1, the antitumor effect of DCCIK cells was much higher than that of CIK cells (P<0.05), and this effect was positively related with the effectortarget ratio. Conclusion The proliferation activity, level of secretory cytokines, and antitumor effect against lymphoma cells of DCCIK cells were significantly higher than those of CIK cells. The research provides theoretical and experimental basis for the immunotherapy of DCCIK cells.

KEY WORDS: cytokineinduced killer cell; dendritic cellscytokine induced killer cell; biological activity; antilymphoma

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells, CIK)是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞[1]。树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原，并诱发细胞毒T淋巴细胞反应[2]。在本研究中，我们通过多种细胞因子组合从正常人外周血中诱导DC、CIK细胞，并将两者共培养，观察DCCIK细胞体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 rhIL2、RPMI 1640培养基及四甲偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品，培养用CD3McAb由Neomarkers公司提供，rhIL1、rhIFNγ、rhTNFα为上海生物制品研究所产品，rhGMCSF为先灵葆雅公司惠赠，rhIL4购自Gibco BRL公司，流式细胞仪标记抗体CD3、CD3CD4、CD3CD8、CD3CD56及检测细胞因子(IL12、IFNγ)的ELISA试剂盒均购自晶美生物工程有限公司，鼠抗人CD1a、CD14、HLADR和FITC兔抗鼠荧光二抗购自中国医学科学院天津血液学研究所。

1.2 靶细胞来源 Raji为人组织淋巴瘤细胞株，引自上海第二医科大学瑞金医院血液学研究所;新鲜淋巴瘤细胞取自外科手术切除的淋巴瘤标本(淋巴结或脾脏)，去除结缔组织和坏死组织，剪成1mm3的组织块，2.5g/L的胰酶消化后过100钢目，经淋巴细胞分离液分离，获得恶性淋巴瘤细胞(malignant lymphoma cells, MLC)，存于液氮中待用。要求靶细胞比例>95%，活体细胞>90%。

1.3 CIK细胞的培养扩增 采集健康人外周血，肝素抗凝，以FicollHypaque淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC)，RPMI 1640洗3次，调细胞密度为4×106/mL;贴壁培养1-2h，收集悬浮细胞用含10%(体积分数)小牛血清(FSC)的RPMI 1640液调细胞密度为1×106/mL，第0天加入rhIFNγ1000u/mL，放置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养24h后加入rhIL2300u/mL、rhIL1100u/mL、CD3McAb 50μg/L，继续培养，以后每3d更换新鲜培养液，补加rhIL2。

1.4 DC的体外培养 参照文献方法[3]。获得健康人外周血MNC中的贴壁细胞，用含10%(体积分数)FSC的RPMI 1640培养基培养，其中包含rhGMCSF 550u/mL，rhIL4500u/mL。隔日半量换液，补加细胞因子，收获前72h再加入rhTNFα 50u/mL，诱导DC成熟。

1.5 DCCIK细胞的培养 收获培养第9天的DC细胞及CIK细胞经活细胞计数后按1∶5混合培养，第3天和第6天，收集细胞做生物学活性测定。

1.6 细胞毒活性的测定 以不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1)，把效应细胞和靶细胞放入96孔板，另设单独靶细胞及效应细胞孔，每孔设3个复孔，置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养48h，按本室建立的MTT法[4]测杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(实验组A-效应组A)/靶细胞A]×100%。

1.7 细胞免疫表型的分析 用流式细胞仪检测CIK及DCCIK细胞的免疫表型;间接免疫荧光法测定DC免疫表型。

1.8 细胞因子的检测 收集培养细胞上清液进行IL12、IFNγ水平测定。采用ELISA双抗夹心法，操作按试剂盒说明。

1.9 统计学处理 数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 增殖能力的观察 CIK细胞培养第6天进入显著增殖期，部分细胞体积明显增大,成丛或集落状悬浮生长。与DC共培养可明显提高CIK细胞增殖速率。培养第15天,经台盼蓝排斥法活细胞计数，CIK细胞总数扩增到原来的(43.57±5.11)倍，而DCCIK细胞为(60.75±4.89)倍，两组差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 培养时间与增殖倍数的关系(略)

Fig.1 The relationship between the culture time and proliferation fold

2.2 细胞表型的分析

2.2.1 DC的形态及表型检测 培养第9天的DC 细胞在倒置显微镜下可观察到典型的树状或毛刺状突起。检测细胞表面分子表达，其特异性标志CD1a的阳性率为(80.56±1.72)%，MHCI类分子HLADR的阳性率为(92.06±3.20)%，CD14的表达率为(8.69±1.76)%。表明此种方法可以诱导较高纯度的成熟DC。

2.2.2 DC与CIK细胞共培养后的免疫表型 CIK细胞单独培养，随着培养时间的延长，CD3+CD8+及CD3+CD56+细胞的比例逐渐增加。与DC共培养的CIK细胞CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞的比例明显高于同条件下未共培养组(P<0.05，表1)。

2.3 体外细胞毒性 共培养3d的DCCIK细胞，对Raji细胞株及新鲜MLC的杀伤活性均明显高于单纯CIK细胞(P<0.05)，且对Raji和MLC杀伤率的影响无差异。在5∶1-40∶1的效靶比范围内，其杀伤作用与效靶比呈正相关(表2)。

表1 CIK和DCCIK细胞免疫表型的变化(略)

Table 1 The phenotype changes of CIK and DCCIK cells

*P<0.05 vs. the same condition CIK

表2 DC CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性(略)

Table 2 Killing activity of DCCIK cells on MLC and cell line Raji

2.4 细胞因子的测定 DC与CIK细胞共培养3d，其上清液中IFNγ、IL12的水平分别为(438.02±213.17)ng/L和(30.65±9.10)ng/L，而同条件下，CIK细胞组IFNγ为(213.96±137.00)ng/L，IL12为(10.10±0.35)ng/L，两组相比，DCCIK细胞分泌IFNγ、IL12的水平显著高于CIK细胞(P<0.05，P<0.01)。

3 讨论

CIK细胞是由多种细胞因子如IL2、IFNγ和CD3单克隆抗体等诱导的一种免疫活性细胞，其兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点[5]。DC摄取、加工、处理抗原，高表达MHCI、MHCⅡ类分子、共刺激分子及黏附分子，在体内外具有激发初次和继发性T细胞免疫应答功能，并能分泌Th1型细胞因子IL12，诱导T细胞和NK细胞产生IFNγ和增强激活NK细胞的细胞毒活性。为此，将具有高效杀瘤活性的CIK细胞和具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC共培养，无疑会起到一定的抗肿瘤协同作用。研究发现DC刺激CIK细胞后，细胞毒活性显著增强[6]。本实验显示DC、CIK细胞一起培养后，共培养物DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用显著高于同条件下单纯CIK细胞。虽然与文献报道[67]有关DCCIK细胞来源、制备方法、效靶比、效靶细胞作用时间以及靶细胞种类不尽相同，但DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性与文献中DCCIK细胞对胰腺癌细胞DANG及CML细胞的杀伤活性强于CIK细胞的结论相同。证实DCCIK细胞确实具有比CIK细胞更强的抗肿瘤活性。CIK细胞属于异质细胞群，其抗肿瘤作用与CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞及分泌细胞因子的水平密切相关。将DC、CIK细胞一起培养后，两者所分泌的细胞因子及表面分子表达发生了变化。研究发现DC与CIK细胞共培养时，DC成熟表面标志CD86、CD80、CD40、HLADR的表达增加[8]。而CD4+CD25+细胞(调节细胞T细胞)和IL10水平下降，对肿瘤细胞的细胞毒活性增强[9]。负载CA199(肿瘤相关抗原)的DC与CIK细胞混合培养24h后IL12的分泌量为CIK细胞单独培养时6.93倍[7]。DC的抗原提呈作用能使CIK细胞分泌IFNγ的时间延长，分泌量增加[10]。我们的实验显示，共培养条件下，DCCIK细胞上清液中IL12、IFNγ分泌量均比同条件下单纯CIK细胞培养分泌高，且CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比例也比CIK细胞组显著增多。说明DCCIK细胞的高杀伤活性与大量增殖的CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞有关，细胞因子IL12、INFγ对杀伤肿瘤也发挥了直接和间接的重要作用。DC能够激活CIK细胞增殖。与DC共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出两倍左右[7]。本研究结果表明，共培养DCCIK细胞不仅具有很强的杀瘤活性，且比同源CIK细胞具有更强的增殖速率，共培养6d，DCCIK细胞总数比单独培养CIK细胞总数多扩增了17倍。说明利用共培养条件可提高CIK细胞的增殖能力，获得大量高效的免疫细胞，这对于肿瘤临床具有重要意义。本研究初步证实，DCCIK细胞增殖活性、抗淋巴瘤作用均高于单纯CIK细胞，这为其临床应用治疗或辅助治疗淋巴瘤提供了实验和理论依据。

基金项目：陕西省“三五人才工程”专项基金资助项目

【参考文献】

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