转移抑制基因MKK4在大肠癌中的表达与其生物学行为及预后的关系

作者                 作者单位

王菊芳  贵阳医学院 病理解剖学教研室， 贵州 贵阳

何常    贵阳医学院 病理解剖学教研室， 贵州 贵阳

陈志英　贵阳医学院 病理解剖学教研室， 贵州 贵阳

[Abstract] Objective: To investigate the expression of mitogenactivated protein kinase kinase 4(MKK4)in colorectal carcinoma and its relationship with the biological behavior and prognosis of the tumor. Methods: MKK4 expression in tissue specimens of 58 cases of colorectal carcinoma and 20 cases of chronic inflammatory were detected by using immunohistochemistry (IHC) method, and Envision twostep staining method. Results: Positive rate of MKK4 protein in colorectal carcinoma tissues ( 75.9 %) was lower than that in chronic inflammatory tissues (100 %). The difference was significant (P<0.05). MKK4 expressions in carcinoma tissues correlated with lymph node metastasis(P<0.05), Dukes stage(P<0.05), invasive depth (P<0.05), and survival time(P<0.05), but not with age, gender, location or tumor volume (P>0.05). Conclusions： MKK4 may play an important role in the progression , metastasis of human colorectal carcinoma，and closely correlates with patients' prognosis.

[Key words] genes, tumor suppressor; carcinoma; intestine, large; mitogenactivated protein kinase kinases; Pathology, clinical; prognosis

转移是肿瘤的主要恶性表型，严重影响肿瘤患者治疗的疗效和预后，肿瘤转移抑制基因的发现为肿瘤转移的诊断和干预治疗提供重要线索。转移抑制基因的功能是当前研究的热点,它们之间一个共同的主题是参与细胞信号转导通路[1]。肿瘤转移抑制基因MKK4/MAP2K4/JNKK1/SEK1(Mitogenactivated protein Kinase Kinase 4/ cJun NH2terminal Kinaseactivating Kinase1/Stressactivated protein/Erk Kinase 1，MKK4)是应激激活蛋白激酶信号级联反应通路的一员，通过直接激活和(或)磷酸化下游信号，最终调控转录因子的活化，介导机体细胞的生长、分化、存活和凋亡。肿瘤转移抑制基因MKK4不同于肿瘤抑制基因，它抑制转移的发展而不影响原发肿瘤的生长。研究发现原发性肝癌中MKK4 mRNA与MMP9 mRNA的表达有一定相关性，二者的表达改变与原发性肝癌侵袭转移的发生发展有一定的关系[2]。有关MKK4介导的JNK/P38通路活化与肿瘤转移抑制关系的研究已经很全面,包括在卵巢癌[3]、前列腺癌[4,5]、胰腺癌[6]和肺癌[7]的发展过程中可抑制肿瘤转移，MKK4的纯合子缺失或表达降低也许促成了卵巢浆液性癌的发展[8]，MKK4在人类大肠癌中的研究尚未见到，本文探讨大肠癌中MKK4蛋白表达及其对大肠癌侵袭转移和预后的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

收集1994-1998年确诊，并保存有完整临床和随访资料的大肠癌标本58例，所有标本均为10 %中性福尔马林固定、石蜡包埋，均为管状腺癌II级。其中，男性28例，女性30例;年龄25～75岁，平均55.76岁;< 50岁18例，≥50岁40例;合并淋巴结转移18例，无淋巴结转移40例;生存期<5年30例，>5年28例。收集同期20例大肠黏膜慢性炎症作为对照。

1.2 主要试剂

MKK4抗体(兔单抗IgG,目录号AB33904)购自深圳市基因谷科技有限公司，PV-9000通用型免疫组化试剂盒、EDTA(PH8.0)抗原修复液和DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

免疫组织化学Envision二步法，严格按照试剂盒说明书操作。每次实验均设置已知乳腺癌切片作阳性对照，PBS代替第一抗体作阴性对照。

1.4 结果判定

通过双盲法由两位有经验的病理专家独立评估。每张染色切片随机选取10个染色均匀的高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞。10个视野阳性细胞平均百分率被认为是阳性细胞百分率;没有阳性细胞赋值为0，30%以下为1，31%～70%为2，>70%为3。染色标准根据每张切片的大多数细胞染色特征决定，没有染色赋值为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。最终结果由染色的总数和染色强度共同决定，总值0表示阴性，0～2为弱阳性，2～4为中等阳性，4～6为强阳性，≤2为低表达，>2为高表达。

1.5 统计学处理

计数资料用χ2检验进行统计学分析,P<0.05差异有显著性。

2 结果

2.1 MKK4表达

MKK4的表达主要定位于细胞浆中，呈棕黄色，胞核中也有少量表达(图1)。MKK4在大肠癌组织中阳性表达率为75.9%，慢性炎症组织中阳性表达率为100%，两组有显著差异(P<0.05)，见表1。表1 MKK4在大肠癌及大肠黏膜慢性炎症组织中的表达(略)注：χ2=4.36,P<0.05。

2.2 MKK4在大肠癌中的表达与临床病理特征的关系

MKK4的表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置无明显相关(P>0.05);与肿瘤的Dukes分期、浸润深度、有无淋巴结转移及生存期有关(P<0.05)。

3 讨论

癌症转移是肿瘤细胞的复杂运动过程，起始于细胞从原发肿瘤扩散，终止于在第二位点形成转移灶。转移的形成需要一系列不连续事件，通常指转移级联反应，即恶性细胞从原发肿瘤脱落，通过血流和淋巴管运输，在第二位点定位、存活并长成可见团块的一个过程。MKK4和转移抑制关系的研究是信号转导和转移研究的结合。Hyung L等[5]检测表明在正常前列腺上皮组织中MKK4高表达，肿瘤组织中MKK4的表达与Gleason分级(前列腺癌转移倾向的预测指标)呈负相关，有显著的统计学意义，证实MKK4蛋白在前列腺癌发展过程中连续下调，并且支持它的信号级联反应失调在临床疾病中的作用。Wei Xin等[6]在根治的原发浸润性胰腺癌标本和转移性胰腺癌标本中发现MKK4免疫标记缺失有着更短生存期的趋势，MKK4阳性的癌症死亡风险是阴性的一半，在胰腺癌MKK4蛋白表达缺失也许比基因失活更常见，并且MKK4缺失也许与疾病进展有关。Donald J等[7]研究表明MKK4的激酶活性对抑制明显转移是必须的，对延长AT6.1鼠自发转移模型动物的生存期是有效的，MKK4通过抑制扩散癌细胞侵袭肺(第二位点)的能力而抑制明显转移的形成;并发现肺扩散癌细胞中的MKK4有活性而原发肿瘤中的没有，这给为什么MKK4特异性抑制转移而不影响原发肿瘤提供了生化解释。

本研究运用免疫组织化学技术检测MKK4蛋白在大肠癌和大肠慢性炎症中的表达，结果显示MKK4的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小无关，与临床分期、浸润深度、有无淋巴结转移和患者预后有关。Dukes C+D期、肿瘤浸润至浆膜外、有淋巴结转移及生存期<5年的大肠癌中MKK4低表达，MKK4可能在大肠癌侵袭转移的发展过程中起重要作用，与患者预后密切相关。提示MKK4信号级联反应的中断和下调，对临床判断结直肠癌的生物学行为和预后有一定实用意义。但是，MKK4在肿瘤中的作用也有不一致的报道。Lei Wang等[9]发现MKK4在乳腺癌中是原癌基因而不是抑癌基因，Wu C等[10]报道胃癌中MKK4表达更低的病人明显有着更长的无病存活期和总生存期。因此，MKK4在正常和恶性组织中表达潜在的器官特异性区别有待于进一步研究。

大多数肿瘤转移能力的获得最终导致临床不可治愈，而大多数临床和基础研究集中在癌症局限和可治愈时的检测和治疗上。与此同时，临床和实验数据的收集证实了癌细胞扩散到第二位点发生得更早更频繁。对转移抑制基因功能和行为的研究也许能够找到癌症治疗的新方法。据推测，信号级联反应调控转移抑制，将给抗转移治疗提供目标，这个目标的达到需要信号转导和转移研究领域的联合努力。

【参考文献】

[1]Kauffman EC,Robinson VL,Stadler WM，et al.Metastasis suppression:the evolving role of metastasis suppressor genes for regulating cancer cell growth at the secondary site[J].J Urol,2003(3):1122-1133.

[2]李明意,姚金科,周小华，等. MKK4、MMP9基因的表达与原发性肝癌肿瘤侵袭转移的关系[J].中国病理生理杂志,2006(8):1480-1483.

[3]Jonathan A Hickson, Dezheng Huo, Donald J Vander Griend，et al. The p38 kinases MKK4 and MKK6 suppress metastatic colonization in human ovarian carcinoma[J]. Cancer Res,2006(66):2264-2270.

[4]Yoshida BA, Dubauskas Z, Chekmareva MA, et al. Mitogenactivated protein kinase kinase4/stressactivated protein/Erk kinase1 [MKK4/SEK1], a prostate cancer metastasis suppressor gene coded by human chromosome17[J]. Cancer Res, 1999(21):5483-5487.

[5]Hyung L Kim, Donald J，Vander Griend ,et al. Mitogenactivated protein kinase kinase 4 metastasis suppressor gene expression is inversely related to histological pattern in advancing human prostatic cancers[J].Cancer Res,2001(61):2833-2837.

[6]Xin W, Yun KJ, Ricci F, et al.MAP2K4/MKK4 expression in pancreatic cancer: genetic validation of immunohistochemistry and relationship to disease course[J]. Clin Cancer Res,2004(24):8516-8520.

[7]Donald J，Vander Griend ,Masha Kocherginsky, et al. Suppression of metastatic colonization by the contextdependent activation of the cJun NH2Terminal kinase kinases JNKK1/MKK4 and MKK7[J]. Cancer Res. 2005(65):10984-10991.

[8]Nakayama K, Nakayama N, Davidson B, et al. Homozygous deletion of MKK4 in ovarian serous carcinoma[J]. Cancer Biol Ther,2006(6):630-634.

[9]Lei Wang, YongPan , Jia Le Dai. Evidence of MKK4 prooncogenic activity in breast and pancreatic tumors[J]. Oncogene,2004(23):5978-5985.

[10]Wu C W, Li A F, Chi C W, et al. Human gastric cancer kinase profile and prognostic significance of MKK4 kinase[J]. Am J Pathol,2000(156):2007-2015.