骨髓间充质干细胞在小鼠早衰性骨质疏松中的细胞生物学功能研究

骨质疏松症是一种多因素所致的慢性疾病,其病理学表现为骨组织显微结构受损,骨质变薄、骨小梁数量减少、骨脆性增加和骨折危险度升高。骨具有发育、增龄、衰老的过程,骨的生物学特点在于保持着稳定的生理性平衡,即成骨和破骨的平衡,任何打破这种平衡的因素都可能导致病理性疾病的发生[1]。关于骨质疏松机制的研究过去主要集中在破骨细胞异常活化上,但是,近些年来,越来越多的学者认为,成骨-破骨平衡破坏才是骨质疏松的根本原因[2]。

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)作为成骨细胞的前体细胞,在骨骼发育和重建过程中发挥着重要作用:随着年龄的增长,BMMSCs的生物学行为也会发生变化,当衰老影响到骨髓间充质干细胞的自我更新和定向分化能力时,骨组织也会和其它组织一样出现退行型病变,其中最典型的便是骨质疏松[3]。通过基因敲除小鼠研究增龄性骨质疏松与骨髓间充质干细胞功能不良的相关性,其中的一些关键基因在BMMSCs成骨分化过程中起重要作用,其缺失可能导致骨质疏松的发生[4-5]。例如,在Bgn-/-小鼠中BMM阢s克隆形成能力下降,凋亡活动增强,合成I型胶原能力降低[4];Casp3-/-/和Casp3+/-小鼠中的BMMSCs骨向分化功能也受到严重损伤[5]。这表明干细胞损伤对于衰老具有不可忽视的作用,同时可能在骨质疏松的发生中起关键性作用[6]。这些结果提示骨质疏松与干细胞功能不良具有明显的相关性。另外,对于骨发育缺陷疾病,已有研究尝试移植骨髓来源的间充质干细胞来重建骨髓的成骨微环境,以治疗严重的成骨不全[7]。并有临床实验表明,通过间充质干细胞的移植可以在一定时间内使成骨不全患者的骨骼生长速度加快,骨质含量提高、骨折发生率下降,说明干细胞将可能成为治疗骨发育、衰老相关疾病的新策略[8]。然而,在年龄的影响下,BMMSCs的生物学功能是否存在缺陷,其发展变化的分子调控机制尚不清楚,关键基因和信号通路对骨相关干细胞的自我更新及分化的调控机制尚未完全清楚。这不仅极大地限制了有效预防骨质疏松为代表的骨增龄疾病的发生,同时限制了干细胞技术治疗增龄所带来的骨质疏松及缺损等疾病的应用。在本研究中,我们使用早衰小鼠模型,通过分离不同年龄段的BMMSCs并比较分析生物学行为,利用基因芯片寻找可能发挥作用的关键信号通路,试图从基因调控水平探寻BMMSCs在增龄性骨质疏松中的重要作用及可能的分子机制。

材料和方法

1  动物模型

SPF级SAMR1与SAMP6小鼠购买于北京大学医学部实验动物中心,实验室常规饲养3个月及6个月用于实验。随机抽取相应的雄性小鼠分为对照组SAMR1小鼠和实验组SAMP6小鼠,每组3只小鼠。

2  主要试剂

SCA-1-FITC、CD29-PE、CD45-PE和∶CD11b-FITC抗小鼠单克隆抗体购自Abcam;DMEM液体培养基和胎牛血清购自Gibco;地塞米松、维生素C、胰岛素、吲哚美辛和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)购自Sigma;Trizol  Reagent 购自Invitrogen;RT-PCR试剂盒购自TaKaRa;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3  主要方法

3.1  骨组织切片染色  小鼠颈椎脱臼致死后,75%乙醇浸泡2-3min消毒,剥取双侧胫骨及股骨,剔除表面肌肉及软组织,多聚甲醛固定24h后于10%EDTA脱钙28d,隔天换液,流水冲洗过后石蜡包埋,常规切片,进行苏木精-伊红(HE)染色。光镜下观察并照相。

3.2  BMMSCs分离培养  小鼠颈椎脱臼致死后,75%乙醇浸泡2-3min消毒,依次剪开皮肤、筋膜达肌肉层,剥去胫骨和股骨,剔除表面肌肉及软组织,以1mL针管冲洗骨髓腔将细胞悬液接种于含20%胎牛血清的DMEM培养基内,37℃、5%C02常规培养。每2d进行半量换液,当细胞融合密度达到8O%以后,以5×102/cm2的密度传代。取P4代以前的细胞用于实验。

3.3  干细胞表面标志物鉴定  取P1代的SAMP6小鼠细胞,弃培养液,PBS洗2次,胰蛋白酶消化3min,DMEM培养液终止,8O0r/min离心5min,弃上清,再用含3%胎牛血清的PBS重悬细胞,使细胞密度达3.0×109/L,分装到离心管中,每管200uL的细胞悬液,室温下每个管分别加入2uLSCA-1-FITC、CD29-PE、CD45-PE和CD11b-FITC抗小鼠单克隆抗体,使用同型对照单克隆抗体确定背景,避光4℃冰箱孵育2h,再用含3%胎牛血清的PBS洗3次,1000r/min离心5min,最后再以3%胎牛血清重悬,用流式细胞仪分析荧光细胞,专用的配套设计软件计算细胞表面抗原阳性表达率,单位用百分比表示。

3.4  BMMSCs的成骨和成脂诱导  成骨诱导液为DMEM加入10%胎牛血清、100nmol/L地塞米松、2mmol/L甘油磷酸钠和50mg/L维生素C;成脂诱导液为DMEM加人10%胎牛血清、200umol/L吲哚美辛0.5mmol/L IBMX10mg/L胰岛素和1umol/L地塞米松。细胞按照3×105cells/we11接种于6孔板内,48h更换成骨成脂诱导液进行培养。每3d换液1次,分别在诱导3d、7d和14d用Trizo1⑧Reagent提取RNA,同时分别对成骨和成脂诱导7d后的BMMSCs进行,碱性磷酸酶(ALP)和油红0染色,在诱导14d后进行茜素红染色;对相关基因[Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)和脂肪酸结合蛋白4(FABM4)进行PCR检测,检测2组细胞中基因表达的差异情况。

3.5  基因芯片检测  取间充质干细胞流式鉴定的同批次3个月及6个月SAMP6小鼠各6只,取股骨及胫骨骨髓常规培养BMMSCs,待原代细胞密度达到80%后分别提取RNA,质检合格后以同组每3个RNA样本等量混合,将得到的每组各3个混合RNA样本行双色芯片检测(华联基因,杭州联川生物信息技术有限公司)。3张芯片的信号数据进行归一化处理后,进行统计学分析。

3.6  RT-PCR检测  按照RT-PCR试剂盒产品使用说明书对所提取RNA进行逆转录反应并用ABI75OORT-PCR仪进行检测。所用引物由上海英杰生命科技有限公司根据设计合成,见表1.

4  统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示,应用SPSS18.0软件进行分析,两组均数比较采用双尾成组t检验分析,以P<0.O5为差异有统计学意义。

结果

1  骨组织切片HE染色

SAMP6早衰小鼠是一种骨特异性衰老模型,骨峰值在3月出现,在4个月即表现出明显的骨质疏松.我们通过对3个月和6个月小鼠股骨骨组织脱钙后进行纵切,切片分析发现与年轻组和同年龄阶段的对照组SAMR1小鼠相比,早衰组出现了明显的骨质疏松。6个月小鼠骨组织皮质骨的厚度、骨表面的宽度和骨小梁的数目均小于3个月对照组,见图1。

2  体外培养BMMSCs表面分子鉴定

小鼠BMMSCs经分离、纯化、培养后呈细长多边形贴壁生长。流式细胞术检测显示:小鼠BMMSCs各个阳性与阴性指标均符合间充质干细胞的特性,见图2。

3  BMMSCs成骨和成脂分化诱导后的比较

取P2代BMMSCs进行成骨与成脂诱导分化,分别在7d进行ALP染色与油红O染色,14d进行茜素红染色。染色结果表明:无论是年轻组还是早衰组,成骨诱导后,ALP活性均上升,且都伴随明显的骨矿化结节形成;但早衰组BMMSCs成骨诱导后,其ALP活性与骨矿化能力均明显不如年轻组与同年龄阶段的正常对照组,且年轻组与正常对照组在不诱导情况下,有轻微的骨矿化能力。

早衰组、年轻组与对照组在不经诱导的情况下,均能自发形成少量的脂肪细胞。经成脂分化诱导后,均出现大量的脂滴累积,但早衰组成脂能力明显最强,见图3。

4  RT-PCR检测结果

与成骨、成脂分化染色BMMSCs同批收取分化7d后的细胞进行基因定量分析,结果表明:早衰组成骨指标Runx2与0sterix的表达明显低于年轻组,而与之相反的是早衰组的成脂指标PPARγ2与FABP4表达显著高于年轻组,这与前面染色结果基本一致,见图4。

5  基因芯片结果通路分析

基因芯片结果显示早衰组与年轻组在约2万6千个基因里,仅164个基因存在显著差异。利用David记在线数据库对该结果进行了通路分析,结果表明有12个信号通路可能调控增龄引起的间充质干细胞功能性改变。首先对其中与骨关系比较密切的TGF-β信号通路中的4个基因(MAPK1、INHBA、DCN和CDF7)进行了差异验证,RT-PCR结果证明芯片结果的可靠性,见表2。

讨论

SAMP6小鼠是一种骨质疏松的早衰小鼠模型,在3-4个月左右即出现明显的骨质疏松病症,已有研究报道这可能与骨发育重建过程中成骨能力受损有很大的关系[9]。而且随着年龄的增大,SAMP6小鼠还表现出骨髓腔里脂肪的累积[10]。但这些研究却没有回答为什么随着年龄增大,SAMP6会表现出这些的生理变化。BMMSCs属于成体干细胞,在一定条件诱导下能够分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞等多类细胞。2006年,Fehrer等[11]曾从增殖的角度简单研究过SAMP6小鼠BMMSCs的基因背景,直到2012年,Mirsadi等[12]才从衰老和多向分化角度系统比较了SAMP6与对照小鼠SAMR1脂肪来源的MSCs的生物学行为。本研究以SAMP6为对象,选取不同年龄的小鼠,分离BMMSCs,从年龄的新角度探讨了BMMSCs在骨质疏松发生发展过程的作用。在去势诱发的骨质疏松条件下,BMMSCs成骨和成脂分化平衡改变,成骨能力下降,趋向成脂分化[l3-14]。有意思的是SAMP6出现骨质疏松后,相比年幼个体,BMMSCs多向分化能力也有类似的转变,这些都为骨质疏松的生理改变提供了细胞生物学证据,BMMSCs基因水平的变化也反映了上述改变。

最新研究结果表明TGF-β信号通路在骨发育重建过程中对BMMSCs的迁移发挥着十分重要的作用[l5]。但在骨衰老过程中是通过影响迁移调控骨重建还是通过其它机制发挥调控作用还有待进一步研究。芯片鉴定出的4个基因在TGF-β信号通路的作用也都还不是特别清楚,因此后续还需对上述4个基因在BMMSCs成骨与成脂分化平衡的具体功能作用机制进行深入研究。

综上所述,在早衰引起的骨质疏松背景下,随着年龄的增长,骨髓间充质干细胞的多向分化能力出现了明显的转变,并且这种变化与骨质疏松的表型相一致,提示骨髓间充质干细胞生物学功能的改变加速了骨质疏松的产生。

参考文献

[1]Hadjidakis DJ,Androulakis II. Bone remodeling[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2006.385-396.

[2]Rodan GA,Martin TJ. Therapeutic approaches to bone diseases[J].Science,2000,(5484):1508-1514.

[3]Pietschmann P,Rauner M,Sipos W. Osteoporosis:an age-related and gender-specific disease[J].Gerontology,2009,(01):3-12.

[4]Wallace JM,Rajachar RM,Chen XD. The mechanical phenotype of biglycan-deficient mice is bone-and gender-specific[J].Bone,2006,(01):106-116.

[5]Miura M,Chen XD,Allen MR. A crucial role of caspase-3 in osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells[J].Journal of Clinical Investigation,2004,(12):1704-1713.

[6]Zhou Z,Apte SS,Soininen R. Impaired endochondral ossification and angiogenesis in mice deficient in membrane-type matrix metalloproteinase Ⅰ[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2000,(08):4052-4057.

[7]Horwitz EM,Gordon PL,Koo WK. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta:Implications for cell therapy of bone[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2002,(13):8932-8937.

[8]Le Blanc K,Gotherstrom C,Ringden O. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfecta[J].Transplantation,2005,(11):1607-1614.

[9]Jilka RL,Weinstein RS,Takahashi K. Linkage of decreased bone mass with impaired osteoblastogenesis in a murine model of accelerated senescence[J].Journal of Clinical Investigation,1996,(07):1732-1740.

[10]Kajkenova O,Lecka-Czernik B,Gubrij I. Increased adipogenesis and myelopoiesis in the bone marrow of SAMP6,a murine model of defective osteoblastogenesis and low turnover osteopenia.Journal of bone and mineral research[J].Journal of Bone and Mineral Research,1997,(11):1772-1779.