p38 MAPK抑制剂SB203580对雨蛙肽诱导的小鼠胰腺组织损伤的影响

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路在炎症、细胞分化、细胞凋亡、应激反应方面发挥着重要的调节作用[l]。p38MAPK最初作为脂多糖(LPS)刺激产生的酪氨酸磷酸蛋白而被鉴定出[2],与其它MAPK信号通路相同,p38MAPK信号通路也是由一套进化上保守、顺序激活的二级激酶组成[3]。各种细胞外刺激,包括紫外线、生长因子、细胞因子、炎症介质和G蛋白偶联受体的配体等均可激活p38MAPK[4]。活化后的p38MAPK可以人核,激活多种转录因子,进而调节各种细胞因子的表达以及细胞凋亡。此外,p38MAPK还能激活细胞内的一些蛋白激酶,进而激活低分子量的热休克蛋白,参与细胞应激反应[5]。SB20358gO(SB)是p38MAPK的特异性抑制剂,许多研究表明它可以抑制炎症性疾病时的炎症介质的表达[6]。本实验通过观测SB对雨蛙肽(CAE)诱导的小鼠离体胰腺组织损伤的影响,探讨p38MAPK信号通路是否参与了该病理过程及其可能的作用机制。

材料和方法

1  动物及分组

体重18-22gC57BL小鼠20只,雌雄各半,购自第二军医大学实验动物中心。实验前小鼠禁食不禁水16h,随机将小鼠分为4组(每组小鼠5只):生理盐水对照组(NS组)、CAE处理组(CAE组)、单用SB组(SB组)及CAE+SB组。

2  小鼠胰腺组织块的分离和培养

参照Jaffrey等[7]的方法,在无菌条件下,将小鼠断颈处死,迅速取出胰腺组织,将其放入HEPES缓冲液中,仔细清除组织上的血管、系膜及脂肪,再用HEPES缓冲液清洗2遍。将胰腺组织放入1mL培养液中剪碎至直径小于0.5mm×0.5mm×0.5mm碎片,静置1min,弃上清,加人新鲜培养液12mL,混匀后均匀分到24孔培养板上并置于5%C02培养箱培养。

3  小鼠胰腺组织刺激后各项指标的检测

根据前期的实验结果[8],胰腺组织块在培养48h过程中存活状况及功能状况良好,此次实验选取基础培养4h后的胰腺组织,用药物进行刺激,CAE终浓度g/mol/L[8],SB终浓度g/mol/L[6],并以NS组作为对照。在药物刺激后1h、4h分别收胰腺组织和培养上清,对以下指标进行检测。

3.1  胰腺组织活力的检测  用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测(南京凯基生物科技发展有限公司),同时用蛋白定量试剂盒(BCA,碧云天生物技术研究所)测定胰腺组织中的蛋白量,计算得出每毫克组织蛋白的组织活力,以此来判断组织损伤情况。

3.2  检测组织培养上清液淀粉酶、脂肪酶、白细胞介素6(IL-6)和细胞因子诱导的中性粒细胞化学趋化因子1(CINC-1)的水平  淀粉酶和脂肪酶活性按照相关生化试剂盒(南京建成生物科技有限公司)说明书介绍的步骤检测。IL-6和CINC-1水平按照相关ELISA试剂盒(R&D)说明书介绍的步骤检测。

3.3  胰腺组织中热休克蛋白60(heat-shock  protein60,HSP60)和HSP70水平的检测   HSP60和HSP70的检测按照相关ELISA试剂盒(R&D)说明书介绍的步骤检测,同时用蛋白定量试剂盒(BCA,碧云天生物技术研究所)测定胰腺组织中的蛋白量,计算得出每毫克组织中的相关蛋白含量。

3.4  检测胰腺组织中p38 MAPK及p-38 MAPK蛋白的表达取胰腺组织加入蛋白裂解液(组成:HEPES 25mmol/L,EDTA 1mmol/L,NaCl2 150mmol/L,MgCl2 10mmol/L,PMSF 1mmol/L,蛋白酶抑制剂10mg/L,1%NP-40,2%丙三醇,pH7.5),匀浆,使之充分裂解,离心取上清,检测样品蛋白浓度(BCA,碧云天生物技术研究所),之后在等浓度样品中加人5×上样缓冲液(碧云天生物技术研究所),95℃煮沸10min使蛋白变性。之后按照参考文献[9]完成SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白转膜操作,上样样品量为40ug。转膜后用5%脱脂牛奶封闭1h,TBST洗涤后将NC膜分别与各个I抗:p38MAPK多克隆抗体,p-p38MAPK多克隆抗体孵育过夜,以GAPDH单克隆抗体(Santa  Cruz,1:1000稀释)作为内参照。TBST洗膜,室温下与辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗(SantaCmz,1:5OO0稀释)孵育2h。ECL化学发光法显色,化学发光成像分析仪曝光、采集图像。用ImageJ分析蛋白条带的光强度,将p38MAPK和p-p38MAP蛋白与内参照光强度的比值进行半定量分析。

4  统计学处理

数据用均数±标准误(mean±SEM)表示,用软件SPSS13.0进行统计学分析,先用Levene方法进行方差齐性检验,若样本`总体符合方差齐性要求,则对其进行单因素方差分析(ANOVA),若样本`总体的方差不齐,采用非参数检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1  离体胰腺组织活力水平的改变

如图1所示,CAE刺激小鼠离体胰腺组织后1h,胰腺组织的活力与对照组比较稍有降低(P>0.05);CAE刺激4h后胰腺组织活力明显降低(P<0.05),而CAE+SB组较CAE组明显升高(P<0.05),但较NS组仍较低(P<0.O5)。

2  培养上清液中淀粉酶和脂肪酶活性的改变

刺激后1h,与NS组比较,CAE组培养上清液中的淀粉酶和脂肪酶活性明显升高(P<0.05);而CAE+SB组中,两者的活性与CAE相比显著降低(P<0.05),与NS组比较仍处于较高水平(P<0.05);SB组与NS组比较无明显差异(P>0.05),见图2。

3  培养上清液中IL-6和CINC-1活性的改变

刺激后Ih,与NS组比较,CAE组培养上清液中的IL-6和CINC-1活性均明显升高(P<0.O5);而CAE+SB组中,IL-6和CINC-1的活性与CAE组相比显著降低(P<0.05),与NS组相比基本相当(P>0.05);SB组与NS组比较无明显差异(P>0.05),见图3。刺激后4h与刺激后1h结果表现趋势一致。

4  胰腺组织中HSP60和HSP7O蛋白的表达

刺激后1h,与NS相比较,CAE组中胰腺组织HSP60和HSP70蛋白表达水平有所升高(P<0.05),而CAE+SB组中,HSP60和HSP70蛋白表达水平与CAE组相比有所降低(P>0.05),与NS组相比基本相当(P>0.O5);SB组与NS组比较无明显差. 

5  胰腺组织中p38和p-p38MAPK蛋白的表达

刺激后1h,与Ns组比较,CAE组中胰腺组织p38和p-p38MAPK蛋白表达水平明显升高(P(0.O5);而CAE+SB组中,p38和p-p38MAPK蛋白表达水平与CAE组相比显著降低(P(0.O5),与Ns组相比基本相当(P>0.05);SB组与NS组比较无明显差异(P>0.05),见图5。刺激后4h与刺激后1h结果表现趋势一致。

讨论

急性胰腺炎是一种始发于胰腺,易于向远隔器官累及的急性炎症性疾病。其病理生理过程复杂,与多种因素相关,包括胰酶的激活、炎症介质、细胞因子等[10]。雨蛙肽是胆囊收缩素(CCK)的类似物,有研究表明它可引起胰酶分泌,大剂量可诱导AP发生[11],目前广泛被应用于AP实验研究。本课题组进行了大量的实验研究证实雨蛙肽可引起胰腺组织的损伤,用雨蛙肽进行在体实验时[9],胰腺病理切片可见组织重度水肿、中性粒细胞浸润等,此外血清淀粉酶、脂肪酶活性升高,促炎细胞因子水平也升高。本实验采用雨蛙肽刺激离体的胰腺组织,同样观测到胰腺组织的损伤,表现为胰腺组织活力下降,同时培养上清液中淀粉酶、脂肪酶、IL-6和CINC-1水平均明显升高。本实验的结果与前期在体实验[9]的结果相一致。

在AP的发生发展过程中,NF-κB的激活占有重要的地位,而p38MAPK信号通路参与了这一调节[12]。p38MAPK的下游蛋白激酶Mn磷酸化后可激活并触发NF-κB的激活和放大[13]。我们以前的研究证实,在小鼠急性胰腺炎模型中,M彩基因敲除鼠的局部和全身炎症反应的表现都较野生鼠减轻[14]。本实验发现,CAE刺激后的小鼠离体组织中p38和p-p38MAPK蛋白表达增高,表明CAE可激活p38MAPK,而p38MAPK特定的抑制剂SB20358O可抑制CAE诱导的p38MAPK的激活,并减弱炎症反应和细胞因子的释放,这进一步证明了∮8MAPK信号通路参与了AP的炎症过程。这一结果与小鼠在体实验结果相一致(结果未发表)。

热休克蛋白是在从细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应急蛋白质,多具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小,热休克蛋白共分为5类,分别为HSP1OO、HsP90、HSP90和Hs%0以及小分子热休克蛋白[15]。研究表明,热休克蛋白有抗凋亡、参与炎症反应等作用[16]。本课题组的前期研究发现,用RNA干扰技术(Hs%0RN如)抑制胰腺组织HS%0的表达,胰腺组织对损伤因子的敏感性增加,促炎细胞因子水平明显高于非干扰组,表明HS%0对胰腺组织具有保护作用[17]。也有学者看到,p38MAPK和HSP90在体内外都会相互影响,认为HSP,0是核易位p38潜在的伴侣因子[18]。在本实验中,CAE刺激小鼠离体胰腺组织后,HSP60和HSP70的表达增加,而使用SB干预后,可使HS%0和HS刀0的表达在一定程度上降低,提示p38MAPK可能参与了热休克蛋白Hs%0和HsP90合成的调节。而HSP60和HSP70的变化是因为炎症反应减轻而使细胞应激程度降低所致,还是失去了p38MAPK的调控作用所致还有待进一步研究。

总之,本次实验的结果显示,在离体小鼠胰腺组织培养中,SB可减轻雨蛙肽造成的损伤,其机制可能与其对炎症介质和细胞因子的抑制有关。本实验进一步证实了p38MAPK信号通路在炎症中的作用,为AP发生机制的阐明和AP的治疗提供了新的思路。

[参考文献]

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