杀菌/通透性增加蛋白基因Glu216Lys多态性与中国汉族人群炎症性肠病无关

炎症性肠病(IBD)是胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)[1-2]。近年来,炎症性肠病在亚洲的发病率显著升高,但其发病机制尚未明确,目前认为IBD是一种复杂的多基因疾病,遗传易感性在其发病中起着重要作用;然而,在目前研究发现的众多与IBD发病、临床特征、药物疗效相关的基因单核苷酸多态性(SNP)中,大部分SNP与欧美IBD相关,而与我国IBD不相关,因此需要进一步研究影响我国IBD人群的基因位点。

宿主对菌群抗原刺激产生的异常免疫反应被认为是IBD重要的发病机制[3-4]。杀菌/通透性增加蛋白(BPI)是参与到宿主识别菌群抗原过程的重要因子,它能够竞争性结合革兰阴性(G-)菌的主要抗原脂多糖(LPS),从而非特异性杀伤G-菌[5],中和LPS;同时,BPI能够抑制LPS与Toll样受体4(TLR4)等结合形成复合物,进而减弱该复合物激活的一系列免疫炎症反应[6-8],见图1。因此,BPI很可能参与到IBD发病中。国外多项研究显示BPI为IBD易感基因,其单核苷酸多态性Glu216Lys(即rs4358188或c.645G>A)与新西兰、德国、土耳其等人群的IBD发病和临床特征相关[9-11],该位点G替换为A能导致谷氨酸变为赖氨酸,可能导致BPI结合LPS结构发生变化,从而可能影响BPI清除细菌、抑制炎症的功能;此外,国内研究者运用基因芯片技术从全基因组大规模筛选IBD易感基因后,发现BPI基因在UC患者外周血单核细胞中较正常人表达上调[12]。因此,BPI很可能是中国人群的IBD易感基因,而关于BPIGlu216Lys与我国人群IBD的关系尚未见报道,本研究将探讨Glu216Lys与我国人群IBD易感性的关系及其对不同临床特征的影响。

材料和方法

1 研究对象

研究对象为我院2003年~2011年IBD门诊及住院确诊的286例IBD患者(包括CD173例,UC113例),以及同期332名在我院接受健康体检的性别、年龄匹配的健康人。IBD的诊断标准参考2007年中华医学会消化病学分会推荐标准[13],即根据临床表现、小肠钡剂造影检查、结肠镜检查、双气囊小肠镜/胶囊内镜和黏膜活检作出临床诊断,确诊病例为经病情观察符合CD/UC病程经过或通过手术取得病理诊断者。IBD的临床分型采用蒙特利尔分型标准[14]。临床资料通过查阅我科IBD数据库获得,主要收集患者的人口学资料及临床分型特征,包括性别、发病年龄、症状、吸烟史、家族史、肠外表现、肛周病变、临床特征等资料。本研究已经中山大学附属第一医院临床研究伦理委员会批准,标本采集获得研究对象的知情同意。

2  方法

2.1  基因组DNA提取  分别采集病例及健康对照2mL外周血,采用天根血液基因组织DNA提取试剂盒(北京天根有限公司提供)提取基因组DNA。具体操作步骤参见试剂盒说明书。

2.2  BPI Glu216Lys基因分型采用引物介导的限制性分析PCR(PIRA-PCR)方法。上游引物5’-CACTATGG-GAAGACCTTACTGATTAC-3’,下游引物5’-CA-GAGTCTGGAAATAAGGTTGAAGC-3’,在下游引物中引入1个A碱基(下划线处),用于构建内切酶HindIII的限制性切点。PCR反应条件:95℃预变性3min;95℃30s,51℃30s,72℃30s,35个循环;72℃1Omin,冷却至4℃保存。PCR产物以限制性内切酶HindIII于37℃酶切2h,再于65℃20min使酶失活。用含溴化乙啶的4%琼脂糖凝胶电泳。

基因型判定:PCR产物为104bp,在HindIII内切酶作用下,A等位基因可被切成78和26bp2个片段(26bp的片段过小,难以检测);G等位基因则不能被切开,电泳显示104bp的条带,见图2。抽样测序结果与电泳结果一致。

3  统计学处理

应用SPSS13.0统计软件行统计学分析。根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律,采用X2检验分析对照组样本的群体代表性。病例组与对照组间Glu216Lys基因型分布频率的比较采用Pearson-X2检验;基因型与IBD临床特征间关系采用单因素和Logistic回归分析,计算优势比(OR)及其95%置信区间(CI),其中0R值经性别和年龄校正。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1  一般情况

病例组纳人的286名IBD病人中,男178(62.2%)例,女108(37.8%)例,平均年龄(33.5±13.1)岁,见表1;正常对照中,男197例(59.3%),女135例(40.7%),平均年龄(32.0±8.2)岁;2组间性别构成比和年龄均无明显差异(均P>0.05)。对照组Glu216Lys基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),具有群体代表性。

2  BPIGlu216Lys基因型在炎症性肠病及对照人群中频率分布

CD和UC病人中,分别检测出GG基因型95(54.9%)和69(61.1%)例,GA基因型68(39.4%)和38(33.6%)例,AA基因型10(5.7%)和6(5.3%)例;对照人群中,GG基因型206(62.1%)例,GA基因型115(34.6%)例,AA基因型11(3.3%)例;无论是CD还是UC病人,Glu216Lys基因型频率及等位基因频率均与对照组无明显差异(P>0.05),见表2。

3  BPI Glu216Lys基因型与IBD临床特征的关系

根据不同临床特征对CD和UC患者进行分层,分析Glu216Lys基因型与疾病各类临床特征的相关性。单因素分析方法结果显示该基因型与UC/CD各临床特征不相关(P>0.O5),为排除混杂因素影响,进一步采用多因素分析方法,经年龄、性别等因素校正后,结果仍显示该基因型与CD或UC的临床特征无关(P>0.O5),见表3、4。

讨论

BPI是先天免疫系统中抵御革兰阴性杆菌的重要因子,它对LPS具有高亲和力,能与G-菌表面LPS及游离LPS结合,进而促进菌体裂解、中和内毒素以及促进补体活化、增强调理吞噬等。BPI在多形核细胞中表达丰富,也广泛地表达于肠道等人体黏膜上皮细胞中[15]。国外研究报道了BPI在IBD患者黏膜中表达升高[16],我国研究[13]发现BPImRNA在UC患者中的相对表达量明显高于正常对照组(P<0.05),国内外研究也发现BPI是IBD患者体内抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的主要靶抗原之一[17],并且BPI自身抗体在IBD中呈高表达,它能增强IBD病人局部和全身炎症,延长炎症持续时间[18];故这些预示BPI可能在IBD中起着重要作用。BPI Glu216Lys可以导致一个氨基酸改变,这可能最终影响BPI蛋白抵御革兰阴性菌的功能,此外,该位点多态性可能改变被核周型ANCA识别的BPI蛋白结构,从而参与IBD疾病过程;BPI单核苷酸多态性位点Glu216Lys已被证实与多国人群IBD易感性有关[9-11],因此,本文研究了Glu216Lys是否与中国人IBD发病及临床特征相关。

我们的研究结果显示BPI Glu216Lys与中国人群CD或UC的发病无明显相关性,进一步分析亦未发现其与疾病临床特征相关。BPI Glu216Lys的GG基因型频率在德国CD患者中相对于正常对照人群明显下降(P<0.O5)[10],而在新西兰人群中,该SNP的A等位基因与回结肠型CD相关(P<0.01,OR=1.16,95%CI:1.14-2.27)[9];此外来自土耳其的研究[11]表明它与UC和CD发病均相关(P<0.01),并且GG基因型在激素依赖患者中表达明显下降(P<O.O5,0R=0.75,95%CI:0.66-0.86)。与这些国家人群相比,我们发现中国人群中野生型纯合子GG基因型频率显著增高,而突变型纯合子AA频率显著下降(P<0.O5),见图3,这进一步证实不同人群存在显著的遗传差异,因此我们的研究结果与这些种族人群的不同,一方面可能是我们的样本量较小,未能发现两者的联系;另一方面,BPJ很可能与其它参与细菌识别过程的IBD易感基因如NOD2/CARD15等相似[8],是白种人的IBD易感基因,而非中国人群的IBD易感基因。

综上所述,本研究表明BPI Glu216Lys位点与我国汉族人群IBD易感性无明显相关性,但不能排除该位点与其它基因位点的相互作用或BPI基因的其它SNP位点与我国汉族人群IBD相关。BPJ基因与中国人群IBD易感性关系仍需要进一步大样本多位点研究,并进行关联分析和单倍体型分析等,以进一步明确该基因多态性在IBD中的作用。

[参考文献]

[1]Farrell R J,Peppercorn MA. Ulcerative colitis[J].The Lancet,2002,(9303):331-340.

[2]Shanahan F. Crohn' s disease[J].The Lancet,2002,(9300):62-69.

[3]Inohara N,Ogura Y,Fontalba A. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2.Implications for Crohn' s disease[J].Journal of Biological Chemistry,2003,(08):5509-5512.

[4]Heumann D,Roger T. Initial responses to endotoxins and Gram-negative bacteria[J].Clinica Chimica Acta,2002,(1-2):59-72.

[5]Weiss J,Elsbach P,Olsson I. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granulcs of human polymorphonuclear leukocytes[J].Journal of Biological Chemistry,1978,(08):2664-2672.

[6]Gazzano-Santoro H,Parent JB,Grinna L. High-affinity binding of the bactericidal/permeability-increasing protein and a recombinant amino-terminal fragment to the lipid A region of lipopolysaccharide[J].Infection and Immunity,1992,(11):4754-4761.

[7]耿彦婷,张军平,徐士欣. PPARs与TLR-NF-κB信号通路[J].中国病理生理杂志,2012,(08):1516-1520.

[8]Li M,GaoX,Guo CC. OCTNand CARD15 gene polymorphism in Chinese patients with inflammatory bowel disease[J].World Journal of Gastroenterology,2008,(31):4923-4927.

[9]Petermann I,Huebner C,Browning BL. Interactions among genes influencing bacterial recognition increase IBD risk in a population-based New Zealand cohort[J].Human Immunology,2009,(06):440-446.

[10]Klein W,Tromm A,Folwaczny C. A polymorphism of the bactericidal/permeability increasing protein (BPI) gene is associated with Crohn' s disease[J].Journal of Clinical Gastroenterology,2005,(04):282-283.